PON1基因過表達(dá)對(duì)急性敵敵畏中毒小鼠膈肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)制.pdf

1、目的:
　　通過體外研究，觀察PON1基因過表達(dá)對(duì)敵敵畏致小鼠膈肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，并研究其保護(hù)機(jī)制。
　　方法:
　　實(shí)驗(yàn)一:構(gòu)建攜帶PON1基因的慢病毒載體，通過觀察綠色熒光以確定慢病毒載體的轉(zhuǎn)染效率，并用RT-PCR、Western blot法檢測(cè)PON1mRNA和蛋白的表達(dá)情況，進(jìn)一步驗(yàn)證過表達(dá)載體的構(gòu)建。常規(guī)培養(yǎng)小鼠膈肌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染過表達(dá)慢病毒載體，將細(xì)胞分為正常對(duì)照組，敵敵畏(DDVP)組，LV-GFP+D

2、DVP組，LV-PON1+DDVP組，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況，RT-PCR及Western blot法檢測(cè)小鼠膈肌細(xì)胞PON1的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)二:常規(guī)培養(yǎng)小鼠膈肌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染過表達(dá)慢病毒載體，將細(xì)胞分為正常對(duì)照組，敵敵畏(DDVP)組，LV-GFP+DDVP組，LV-PON1+DDVP組，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞乙酰膽堿酯酶(AchE)水平、血紅素氧合酶1(HO-1)、醌氧化還原酶1(NQO-1)，RT-PC

3、R、Western blot法檢測(cè)小鼠膈肌細(xì)胞核因子NF-E2相關(guān)因子水平(Nrf2)的表達(dá)情況，化學(xué)比色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活力及丙二醛(MDA)水平。
　　結(jié)果:
　　實(shí)驗(yàn)一:
　　(1)過表達(dá)慢病毒載體的驗(yàn)證:熒光顯微鏡下觀察小鼠膈肌細(xì)胞中綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，慢病毒載體的轉(zhuǎn)染率達(dá)到80％以上。RT-PCR、Western blot法結(jié)果顯示小鼠膈肌細(xì)胞在轉(zhuǎn)染LV-PON1

4、后PON1mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高，與空白對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(2)80μ mol/L DDVP誘導(dǎo)24h可明顯抑制小鼠膈肌細(xì)胞的生長(zhǎng)，生存率為82.1％，并呈現(xiàn)劑量依賴性。160umol/LDDVP誘導(dǎo)小鼠膈肌細(xì)胞6、12、24h后，細(xì)胞的存活率分別為76.1％、66.5％、53.6％，呈時(shí)間依賴性。
　　(3)PON1基因過表達(dá)對(duì)DDVP誘導(dǎo)后小鼠膈肌細(xì)胞PON1mRNA及蛋白表達(dá)的影響

5、:與正常對(duì)照組相比，160umol/L DDVP誘導(dǎo)24h后， DDVP組和LV-GFP+DDVP組PON1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與DDVP組相比，LV-PON1+DDVP組PON1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(4)PON1基因過表達(dá)對(duì)DDVP誘導(dǎo)后小鼠膈肌細(xì)胞生存率的影響:160μ mol/L DDVP誘導(dǎo)小鼠膈肌細(xì)胞，各組細(xì)胞生長(zhǎng)受抑

6、制的程度具有時(shí)間依賴性。誘導(dǎo)24h，各組細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯受抑，與正常對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。PON1基因過表達(dá)能明顯抵抗DDVP對(duì)小鼠膈肌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)DDVP組和LV-GFP+DDVP組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(5)PON1基因過表達(dá)對(duì)小鼠膈肌細(xì)胞凋亡率的影響:PON1基因過表達(dá)能抑制DDVP誘導(dǎo)所致小鼠膈肌細(xì)胞的凋亡，與DDVP組相比，LV-PON1+DDVP組細(xì)胞的

7、凋亡率減少。
　　實(shí)驗(yàn)二:
　　(1)PON1基因過表達(dá)對(duì)DDVP誘導(dǎo)小鼠膈肌細(xì)胞后AchE水平的影響:160umol/L DDVP誘導(dǎo)后，各組細(xì)胞AchE水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均下降，且呈時(shí)間依賴性。與正常對(duì)照組相比，DDVP組和LV-GFP+DDVP組細(xì)胞AchE水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);LV-PON1+DDVP組AchE水平明顯高于DDVP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(2)PON1基因

8、對(duì)DDVP誘導(dǎo)后小鼠膈肌細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響:與正常對(duì)照組相比，各時(shí)間點(diǎn)DDVP組和LV-GFP+DDVP組SOD、CAT活力降低，MDA含量升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);LV-PON1+DDVP組SOD、CAT活力明顯高于DDVP組，MDA含量明顯低于DDVP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(3)PON1基因過表達(dá)對(duì)DDVP誘導(dǎo)小鼠膈肌細(xì)胞后Nrf2mRNA和蛋白表達(dá)的影響:DDVP誘導(dǎo)24小時(shí)后，LV

9、-PON1+DDVP組Nrf2 mRNA和蛋白的表達(dá)升高，與DDVP組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(4)PON1基因過表達(dá)對(duì)DDVP誘導(dǎo)小鼠膈肌細(xì)胞后HO-1和NQO-1水平的影響:與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)DDVP組相比，LV-PON1+DDVP組HO-1、NQO-1的水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、PON1基因過表達(dá)能有效保護(hù)小鼠膈肌細(xì)胞，降低DDVP對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，減少