陽離子聚合物β-CD-PAMAM作為基因載體的評估.pdf

1、糖尿病患者皮膚易損，且一旦出現(xiàn)傷口很難愈合。其原因主要包括：(1)患者全身因素(如代謝營養(yǎng)狀況、免疫力等)；(2)傷口局部因素(如是否合并感染、周圍組織的血管病變、神經(jīng)病變等)；(3)傷口微觀的改變(過量的基質(zhì)金屬蛋白酶分泌、生長因子缺乏、組織增殖能力降低、微循環(huán)的異常、炎癥因子分泌過多等)。這些原因最終導(dǎo)致細胞外基質(zhì)合成和降解的失平衡，從而影響潰瘍愈合。
　　 基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)家族中的

2、一員，又稱明膠酶B，是依賴Zn2+的金屬酶。在糖尿病病理狀態(tài)下：(1)研究發(fā)現(xiàn)糖尿病病人的足潰瘍滲出液中基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的水平較正常人升高。(2)本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠皮膚MMP-9的水平較正常大鼠明顯增高，MMP-9/TIMP-1(組織金屬蛋白酶抑制劑-1)之間平衡失調(diào)，細胞外基質(zhì)過度降解，可能與糖尿病大鼠傷口愈合減慢有關(guān)。(3)在糖尿病足患者中，單純局部應(yīng)用生長因子并不能加快潰瘍愈合，考慮可能與MMP-9的升高

3、加速降解生長因子、生長因子受體、整合素及其受體，從而加重傷口局部炎癥反應(yīng)，減慢傷口愈合。因此抑制傷口局部MMP-9的表達是促進糖尿病足傷口愈合的可選擇方法之一。然而目前還沒有特異性MMP-9抑制劑，且MMPs抑制劑(TIMP)價格十分昂貴，不適合臨床常規(guī)使用，所以，通過RNA干擾技術(shù)抑制糖尿病傷口MMP-9的表達成為可供選擇的方法之一。
　　 RNA干擾(RNA interference,RNAi)近年來發(fā)展迅速，已經(jīng)從基礎(chǔ)研究

4、發(fā)展到臨床應(yīng)用。RNA干擾技術(shù)的核心是通過內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA(dsRNA)介導(dǎo)的細胞內(nèi)mRNA發(fā)生特異性降解，導(dǎo)致靶基因的表達沉默，產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失，這種依賴于dsRNA的轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程被稱為RNA干擾。此技術(shù)的關(guān)鍵步驟之一就是將基因轉(zhuǎn)導(dǎo)進入細胞的技術(shù)。
　　 基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)需要高效率、高安全性的載體，由于病毒載體潛在的安全性問題，很大程度限制了其在體內(nèi)實驗中的應(yīng)用，故人們一直致力尋找新的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)載體。非病毒載體中的

5、新型陽離子聚合物目前受到極大關(guān)注，因為其具有以下優(yōu)點：(1)無免疫原性，不會引起機體的免疫反應(yīng)；(2)通過控制粒徑尺寸和表面性質(zhì)可控制載體的生理行為；(3)可根據(jù)需要設(shè)計載體的分子結(jié)構(gòu)；(4)遺傳物質(zhì)的釋放可做到由聚合物基質(zhì)的降解速率決定。陽離子聚合物與核酸帶負電的磷酸基團通過靜電相互作用形成復(fù)合物后與細胞表面帶負電的蛋白多糖相互作用，并通過內(nèi)吞作用進入細胞。中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院高分子研究所張黎明教授課題組通過分子設(shè)計合成星型陽離

6、子聚合物β-CD-PAMAM，該聚合物具有以下優(yōu)點：(1)具有良好的水溶性和生物相容性；(2)可與siRNA形成納米粒；(3)表面大量的陽離子基團，提供了進一步功能化的可能。但該聚合物生物安全性、對siRNA的結(jié)合和轉(zhuǎn)導(dǎo)能力如何還不明確。β-CD-PAMAM的化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：
　　 研究目的:
　　 1.了解β-CD-PAMAM的細胞毒性。
　　 2.探討β-CD-PAMAM與MMP-9特異性siRNA的結(jié)合能力。

7、
　　 3.β-CD-PAMAM介導(dǎo)FAM標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染效率評估。
　　 4.β-CD-PAMAM介導(dǎo)的RNAi對大鼠皮膚成纖維細胞CRL1213MMP-9抑制效果評估。
　　 材料與方法:
　　 所用細胞為大鼠皮膚成纖維細胞株CRL1213(編號4032860)，購自美國組織培養(yǎng)庫(ATCC)。
　　 1.β-CD-PAMAM的細胞毒性實驗(MTT法)
　　 將大鼠皮膚成纖維細胞株

8、CRL1213分為正糖培養(yǎng)組(5.6mmol/L)和高糖培養(yǎng)組(25mmol/L)，每種糖濃度組再根據(jù)β-CD-PAMAM的終濃度分為21.3ug/ml、16.0ug/ml、10.7ug/ml、5.3ug/ml、2.1ug/ml及空白對照組，每組設(shè)五個復(fù)孔，加入β-CD-PAMAM后24h、48h、72h測各組在492nm的OD值。細胞活力(％)=[A492(實驗組)/A492(對照組)]×100，實驗重復(fù)三次結(jié)果取平均值。
　　

9、 2.瓊脂糖凝膠電泳檢測新型陽離子聚合物β-CD-PAMAM與siRNA結(jié)合能力β-CD-PAMAM與MMP-9特異性siRNA按照質(zhì)量比40∶1、30∶1、20∶1、10∶1、4∶1混合后行瓊脂糖凝膠電泳，帶正電荷的聚合物與帶負電的siRNA會通過電荷作用互相結(jié)合，若陽離子聚合物的量足夠，會與siRNA充分結(jié)合，則瓊脂糖凝膠電泳顯示siRNA被阻滯在上樣孔內(nèi)，或向負極泳動。
　　 3.β-CD-PAMAM介導(dǎo)FAM標(biāo)記的si

10、RNA轉(zhuǎn)染效率評估
　　 將大鼠皮膚成纖維細胞株CRL1213分為正糖培養(yǎng)組(5.6mmol/L)和高糖培養(yǎng)組(25mmol/L)，在每種糖濃度下，β-CD-PAMAM與siRNA按照質(zhì)量比分為40∶1、30∶1、20∶1、10∶1、4∶1組，同時設(shè)Lipofectamine2000與siRNA混合組。轉(zhuǎn)染后24小時內(nèi)通過激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果，流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率及細胞死亡數(shù)，篩選出轉(zhuǎn)染效率最優(yōu)體系。實驗重復(fù)三次結(jié)果取

11、平均值。
　　 4.β-CD-PAMAM介導(dǎo)的RNAi對大鼠皮膚成纖維細胞CRL1213MMP-9抑制效果評估
　　 將大鼠皮膚成纖維細胞株CRL1213分為正糖培養(yǎng)組(5.6mmol/L)和高糖培養(yǎng)組(25mmol/L)，行qRT-PCR檢測MMP-9表達。高糖+脂多糖(LPS)1ug/ml18小時刺激建立MMP-9高表達細胞模型后再次行qRT-PCR檢測MMP-9表達。然后將篩選出的β-CD-PAMAM介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染效率

12、最優(yōu)體系和Lipofectamine2000介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染體系轉(zhuǎn)染細胞，24小時后行qRT-PCR檢測MMP-9表達。評價β-CD-PAMAM介導(dǎo)的RNAi對大鼠皮膚成纖維細胞CRL1213MMP-9抑制效果。實驗重復(fù)三次結(jié)果取平均值。
　　 5.統(tǒng)計學(xué)分析
　　 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，多組間兩兩比較用Bonferroni法