uPA-uPAR在皮膚上皮化-再上皮化過程中表達及作用的初步研究.pdf

1、蛋白水解酶的水解過程對于正常的生理功能是必需的，包括正常的血管維持，血管的形成，凝塊的形成和溶解，骨的重塑以及排卵等。這些酶系統(tǒng)的上述作用同樣適用于癌細胞的生長和遷移，通過降解基底膜以及細胞外基質，以利于細胞的遷移。降解胞外基質的蛋白水解酶主要包括三種：基質金屬蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶以及絲氨酸蛋白酶。其中絲氨酸蛋白酶中的uPA系統(tǒng)起著重要的作用。 在uPA系統(tǒng)中，uPA/uPAR作用更為重要。以往的研究表明，uPA/uPAR在正

2、常皮膚中無表達，但在皮膚的腫瘤組織以及創(chuàng)傷后表達強烈。但以往的研究對uPA/uPAR在胚胎發(fā)育期的情況以及功能方面研究較少；在創(chuàng)傷愈合過程的早期，uPAR表達強烈，但其作用如何，以往文獻未見報道。 因此，本研究以uPA/uPAR為研究對象，首先，通過免疫組織化學以及原位雜交技術研究uPA/uPAR在胚胎發(fā)育期皮膚及毛囊的表達情況；由于人體研究的局限性，通過構建含uPAATF以及uPAR的綠色熒光蛋白，并分別轉染到小鼠永生化細胞株

3、Pam212，分別檢測轉染后對細胞增殖遷移的影響；將構建的綠色熒光蛋白經(jīng)注射、電穿孔后觀察對在體小鼠創(chuàng)傷愈合的影響。主要結果如下： 1、采用免疫組織化學及原位雜交技術檢測在胚胎發(fā)育期皮膚及毛囊中uPA的表達情況。以往我們的研究表明，在胚胎發(fā)育期皮膚和毛囊中有uPAR蛋白及mRNA的表達。uPA與uPAR一般相伴而生，結果發(fā)現(xiàn)：(1)在胚胎發(fā)育期的表皮及毛囊中有uPA的表達；(2)在毛囊發(fā)育的起始階段，uPA蛋白及mRNA主要在表

4、皮的基底層、最外層、皮上層以及毛囊芽中表達；在延長期，在表皮的表達與起始階段相似，在毛囊的最外層有表達；在球形毛囊釘期和分化的階段早期，表皮的基底層以及毛囊的外根鞘中有表達，并且在毛囊隆突區(qū)也有著色，而在胚胎晚期未檢測到表達。(3)uPA的表達強度表現(xiàn)為逐漸升高，而在分化期表達較高，然后降低，直至未能檢測到。本實驗結果表明，在胚胎發(fā)育期的正常皮膚及其附屬器毛囊中有uPA/uPAR的表達，并且推測表達與表皮及毛囊細胞的增殖、遷移相關。

5、 2、采用質粒構建，將uPAATF片斷構建到綠色熒光蛋白質粒中，然后進行轉染，將構建的質粒轉染到小鼠永生化細胞株Pam212細胞中，通過MTT細胞活性實驗，Transwell細胞侵襲實驗來觀察質粒轉染對細胞的影響。結果發(fā)現(xiàn)：細胞轉染uPAATF質粒后，形成的uPAATF蛋白能抑制細胞的生長，并且降低了細胞的侵襲能力。 3、采用質粒構建，將全長的uPAR片斷構建到綠色熒光蛋白質粒中，再轉染到Pam212細胞中，通過MTT實驗測

6、細胞活性，Transwell檢測細胞的侵襲能力，結果發(fā)現(xiàn)：轉染含uPAR質粒后，促進了細胞的生長，并且提高了細胞的侵襲能力。 4、將提取的無內毒素的質粒，注射到創(chuàng)傷的小鼠皮下，通過電轉移法，將質粒轉染到細胞內，通過綠色熒光觀察，創(chuàng)面愈合率的測定，HE、Masson染色，組織形態(tài)學的觀察，以及創(chuàng)傷面羥脯氨酸和蛋白含量的測定。結果表明：(1)電轉移法是實用可行的一種物理轉移的方法，是基因治療的一種新手段；(2)轉染uPAR質粒合成的

7、蛋白位于創(chuàng)傷面角質形成細胞的前沿；(3)轉染uPAR質粒的創(chuàng)傷愈合率高于空質粒轉染組和uPAATF質粒轉染組；(4)Masson染色顯示轉染uPAR質粒新合成膠原網(wǎng)狀結構致密，優(yōu)于對照組和uPAATF組；(5)肉芽組織膠原蛋白及羥脯氨酸含量變化不大，可能與新生肉芽組織含水量較高有關?？傊瑒?chuàng)傷后轉染uPAR質粒，能促進表皮角質形成細胞的遷移增殖。 綜上所述，本課題表明，在人胚胎發(fā)育期皮膚及毛囊中有uPA蛋白及mRNA的表達，以往