一種新型抗菌活性多糖的研究.pdf

1、抗生素與化學(xué)殺菌劑濫用等原因造成耐藥菌快速出現(xiàn)和廣泛傳播,對人類的生命健康造成了嚴重威脅。不斷研究開發(fā)新型的廣譜、高效、安全的生物殺菌劑來有效地控制日益嚴重的耐藥菌感染是人們必須要解決的重要課題。
　　本課題組從湖北省大別山區(qū)土壤中篩選到一株的鏈霉菌(Streptomyces)。該菌株能產(chǎn)生一種胞外多糖,這種多糖具有獨特的抗菌活性。本文從產(chǎn)多糖鏈霉菌的分類鑒定、多糖的制備與理化性質(zhì)分析、多糖的結(jié)構(gòu)分析、產(chǎn)多糖培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝優(yōu)化、

2、抗菌活性、抗菌機理及其應(yīng)用方面展開了較為系統(tǒng)的研究,取得的研究成果如下:
　　(1)從菌種的形態(tài)、生理生化、培養(yǎng)特征、細胞壁組成以及分子分類等方面對產(chǎn)多糖菌株H03進行分類鑒定,確定其在分類學(xué)上的地位。結(jié)果表明,所篩選的菌株H03為典型的鏈霉菌,其生理生化特征與模式菌株白色鏈霉菌相同,而且具有I型細胞壁,符合鏈霉菌屬(Streptomyces)的化學(xué)分類特性,將其與放線菌中各屬的典型菌株進行系統(tǒng)發(fā)育分析,并構(gòu)建進化樹。發(fā)現(xiàn)它和St

3、reptomyces virginae ATCC20313的相似性最高,因此,將其歸屬于維吉尼亞鏈霉菌,并命名為Streptomyces virginaeH03。菌株的16srDNA部分堿基序列保存在GenBank database中,其編號為DQ989584,并保藏在菌種保藏中心(中國,武漢),其編號為CCTCC M207049。
　　(2)研究了抗菌活性多糖的分離純化工藝,利用鹽析法去掉蛋白質(zhì)后,采用乙醇沉淀法獲得粗多糖,然后

4、利用透析法除去小分子物質(zhì),最后通過凝膠層析獲得多糖純品,最后對其進行純度、理化性質(zhì)以及毒性等方面進行了分析。結(jié)果表明,該活性多糖為灰白色粉末,溶于水,不溶于乙醇、乙醚、丙酮等有機溶劑;純化后的樣品通過紫外光譜分析不含蛋白質(zhì)等雜質(zhì);硫酸-苯酚法測得多糖含量為96.2％,而且小鼠經(jīng)口毒性試驗和細胞毒性試驗表明該多糖是安全的。
　　(3)采用凝膠過濾法測定多糖的相對分子質(zhì)量、GC-MS檢測多糖的單糖組成、高碘酸氧化、Smith降解、NM

5、R等技術(shù)分析各種多糖的單糖連接方式、組成結(jié)構(gòu)單元等。結(jié)果表明,該活性多糖的相對平均分子質(zhì)量為3.76×104D,其單糖組成為甘露糖、葡萄糖和半乳糖,三種單糖的摩爾比例大約是2:1:1,其可能的結(jié)構(gòu)式為:
　　(4)利用單因素分析、響應(yīng)面法以及正交設(shè)計法來優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件,確定最佳的發(fā)酵工藝,最后通過發(fā)酵罐實驗進行驗證。結(jié)果表明,較為適合的培養(yǎng)基配方為:葡萄糖3.2%、淀粉2%、(NH4)2SO40.33%、黃豆餅粉0.28

6、%、NaCl0.2%、MgSO40.4%、K2HPO40.4%和0.03%CaCO3,初始pH7.4~7.6。發(fā)酵工藝條件為:種齡為48h,接種量為10%,溫度30℃,發(fā)酵周期為120~144 h,攪拌器轉(zhuǎn)速為250rpm。發(fā)酵罐驗證的結(jié)果表示,優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝有利于鏈霉菌積累多糖,最大多糖產(chǎn)量可達27.9g/L。
　　(5)研究了多糖抗病原細菌、真菌的活性,并對其抗細菌機理進行了深入探討。結(jié)果表明,該鏈霉菌多糖的抗菌

7、譜較廣,對多種病原細菌、植物病原真菌以及酵母都有較強的抗菌活性,沒有表現(xiàn)出對革蘭氏陽性菌和陰性菌的選擇性抗菌活性。該多糖的抗細菌機理在于能破壞金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的細胞壁,引起細胞膜的通透性增加或破裂,導(dǎo)致胞內(nèi)可溶性蛋白及其他物質(zhì)外漏,還能破壞胞內(nèi)的DNA結(jié)構(gòu),最終導(dǎo)致細胞死亡。此外,該鏈霉菌多糖具有較好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性。
　　(6)多糖的應(yīng)用結(jié)果表明,該多糖在油菜菌核病防治、醬油保鮮以及魔芋軟腐病的防治等方面具有非常好