神經(jīng)生長因子受體p75NTR抑制肝癌生長的機制研究.pdf

1、p75NTR(p75neurotrophinreceptor)是神經(jīng)生長因子(neurotrophin,NT)的低親和力受體，由427個氨基酸組成，屬于腫瘤壞死因子受體超家族(TNFR)的一員。p75NTR不僅在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中起重要作用，而且在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也起重要作用。
　　既往的研究表明，p75NTR是一個潛在的抑癌基因，它可以抑制前列腺癌細胞的生長。然而有報道認為p75NTR也可以作為生存受體促進黑色素瘤細胞的腦轉(zhuǎn)移，這

2、一矛盾提示p75NTR在不同的腫瘤中可能發(fā)揮了不同的作用。我科先前的研究發(fā)現(xiàn)，p75NTR在胃癌中的表達顯著低于癌旁組織，p75NTR可以抑制胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。迄今為止，p75NTR在肝癌中的表達情況及在肝癌生長中的作用尚不清楚，本課題將對此進行探討。
　　【目的】
　　1、研究p75NTR在肝癌及癌旁組織中的表達情況；2、研究p75NTR對肝癌細胞生長的影響；3、探討p75NTR誘導肝癌細胞周期阻滯的可能機制。
　　

3、【方法】
　　1、利用免疫組化方法研究p75NTR在肝癌及癌旁組織中的表達。2、WesternBlot方法檢測肝癌細胞系和正常肝細胞系中p75NTR的表達。3、通過基因重組方法構(gòu)建p75NTR的siRNA載體，轉(zhuǎn)染Chang細胞，G418篩選，獲得穩(wěn)定克隆。構(gòu)建p75NTR的正義表達載體，轉(zhuǎn)染HepG2細胞，G418篩選，獲得穩(wěn)定克隆。4、對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞利用Westernblot技術(shù)鑒定不同載體的轉(zhuǎn)染效果。5、MTT法繪制轉(zhuǎn)染細

4、胞及對照細胞的生長曲線。6、流式細胞儀分析轉(zhuǎn)染細胞和對照細胞的細胞周期分布。7、利用Hoechst33258染色法和流式細胞儀分析法檢測轉(zhuǎn)染細胞的凋亡百分率。8、軟瓊脂克隆形成實驗觀察轉(zhuǎn)染細胞和對照細胞在體外的成瘤能力。9、裸鼠成瘤實驗觀察轉(zhuǎn)染細胞及其對照細胞的體內(nèi)成瘤能力。10、用Westernblot法檢測轉(zhuǎn)染細胞中細胞周期相關(guān)分子表達水平的變化。
　　【結(jié)果】
　　1、利用免疫組化技術(shù)檢測了p75NTR在肝癌和癌旁組織

5、中的表達，發(fā)現(xiàn)p75NTR在肝癌組織中的表達顯著低于癌旁組織，肝癌的分化程度越低、臨床分期越差則p75NTR的表達也越低。2、WesternBlot方法檢測肝癌細胞系和正常肝細胞系中p75NTR蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)p75NTR在正常肝細胞系中表達較高，而在肝癌細胞系中表達較低。3、構(gòu)建了p75NTR的siRNA載體，將其轉(zhuǎn)染Chang細胞，G418篩選獲得穩(wěn)定表達的克隆，經(jīng)蛋白水平檢測證實成功建立了p75NTR下調(diào)的穩(wěn)定細胞系。同時構(gòu)建了p

6、75NTR的正義表達載體，將其轉(zhuǎn)染HepG2細胞，G418篩選獲得穩(wěn)定表達的克隆，經(jīng)蛋白水平檢測證實成功建立了p75NTR上調(diào)的穩(wěn)定細胞系。4、用MTT法檢測細胞生長情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p75NTR-siRNA轉(zhuǎn)染的Chang細胞生長加快，而p75NTR正義轉(zhuǎn)染的HepG2細胞生長減慢。5、細胞周期檢測顯示，p75NTR-siRNA轉(zhuǎn)染的Chang細胞增殖指數(shù)增加，G1/S期的轉(zhuǎn)換加快；而p75NTR正義轉(zhuǎn)染的的HepG2細胞增殖指數(shù)降低，

7、發(fā)生G1/S期的阻滯。6、Hoechst33258染色法和流式細胞儀分析法檢測轉(zhuǎn)染細胞的凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p75NTR正義轉(zhuǎn)染的HepG2細胞的凋亡百分率增加。7、軟瓊脂克隆形成實驗顯示，p75NTR正義轉(zhuǎn)染的HepG2細胞生長減慢，克隆形成率顯著低于對照細胞。8、裸鼠體內(nèi)成瘤實驗結(jié)果顯示，p75NTR正義轉(zhuǎn)染的HepG2細胞的成瘤性顯著低于對照細胞。9、Westernblot檢測轉(zhuǎn)染細胞的細胞周期相關(guān)分子發(fā)現(xiàn)，p75NTR表達的下調(diào)

8、使PCNA、CyclinD1和p-Rb的表達上調(diào)，但使Rb的表達下調(diào)；p75NTR表達的上調(diào)使PCNA、CyclinD1和p-Rb的表達下調(diào)，但使Rb的表達上調(diào)。這提示p75NTR通過上述機制引起了G1/S期的阻滯。
　　【結(jié)論】
　　1、p75NTR在肝癌組織中的表達顯著低于癌旁組織，肝癌的分化程度越低、臨床分期越差則p75NTR的表達就越低。2、p75NTR可以抑制肝癌細胞的增殖，促進肝癌細胞的凋亡，從而抑制了肝癌細胞的