雞INR的顯微形態(tài)及SP-mRNA的分布.pdf

1、腸Remak神經(jīng)(Intestinal nerve of Remak，INR)是禽類特有的一條自主神經(jīng)節(jié)鏈，由空腸和十二指腸交界處延伸至泄殖腔，其間頻繁地發(fā)出分支到腸道。不同于哺乳動物，禽類腸神經(jīng)系統(tǒng)由內(nèi)源性神經(jīng)叢和INR共同組成，INR對禽類的消化、生殖都有重要的調(diào)節(jié)作用。P物質(zhì)(Substance P，SP)是一種由11個氨基酸組成的腦腸肽，對維持腸道的正常功能起到重要的作用。本試驗在光鏡下研究雞INR的顯微形態(tài)，合成地高辛標記SP

2、-RNA探針并用ISHH的方法從基因水平研究了SP-mRNA在INR內(nèi)的分布，為進一步研究禽類特有的INR對消化、免疫和生殖等生理過程的調(diào)節(jié)作用提供形態(tài)依據(jù)。 試驗Ⅰ雞INR顯微形態(tài)學研究INR是禽類特有的一條神經(jīng)節(jié)鏈。取雞INR制備冰凍切片并將切片分別進行蘇木精-伊紅和甲苯胺藍染色。在光鏡下觀察INR內(nèi)神經(jīng)元的形態(tài)，統(tǒng)計神經(jīng)元的數(shù)量，測量神經(jīng)元的面積并用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行分析。通過觀察發(fā)現(xiàn)，不同腸段腿內(nèi)神經(jīng)元的形態(tài)存在差

3、異。數(shù)量統(tǒng)計顯示INR神經(jīng)節(jié)內(nèi)包含大量的神經(jīng)元胞體，一只雞的INR內(nèi)神經(jīng)元的總數(shù)為31821個，并且直腸段INR內(nèi)的細胞數(shù)量最多，為27109個。空腸段INR內(nèi)神經(jīng)元的平均面積最大，達到478.46μm<'2>，面積較大的神經(jīng)元所占的比例也最高；而直腸段INR內(nèi)單個神經(jīng)元的平均面積最小，約為391.74μm<'2>?？梢酝茰y不同段INR中神經(jīng)細胞的形態(tài)、大小和數(shù)量具有一定差異，這種差異可能與其對胃腸道功能的調(diào)節(jié)有關(guān)。 試驗Ⅱ S

4、P-mRNA探針的合成以GenBank中查得的序列號為XM_418674的SP-mRNA序列為參照設(shè)計引物。提取雞的總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄套式PCR擴增目的片段從雞的總RNA中擴增SP基因片段，將目的DNA的純化回收后，用TA克隆的方法將目的片段克隆到pGM-easyT載體中并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽性克隆，測序鑒定為目的片段。分別利用pGM-T easy質(zhì)粒中T7和SP6啟動子及T7和SP6RNA聚合酶，以線性化的SP/pGM-T easy

5、為模板轉(zhuǎn)錄合成正、反義DIG標記RNA探針。將合成好的DNA探針進行純化，然后進行斑點雜交實驗檢驗探針的標記效率和濃度。斑點雜交實驗表明探針合成成功，濃度接近100 ng/μl，可以用于ISHH試驗。 試驗Ⅲ INR內(nèi)的原位雜交反應(yīng)通過原位雜交(in situ hybridization histochemistry，ISHH)技術(shù)，用自行合成的探針探查SP-mRNA在雞INR中的分布情況。結(jié)果表明，雞INR中ISHH陽性神經(jīng)