黃粉蟲(chóng)抗凍蛋白基因的克隆及應(yīng)用研究.pdf

1、現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種生物具有抗凍或者抗凍相關(guān)基因，它們編碼的蛋白質(zhì)利用氫鍵與冰晶，連接阻止冰晶的進(jìn)一步增長(zhǎng)，從而降低體液的結(jié)冰點(diǎn)?？箖龅鞍讖V泛存在于不同生物體中，包括魚(yú)類(lèi)、昆蟲(chóng)、植物、細(xì)菌和真菌。在低溫時(shí)，植物可以利用體內(nèi)的一些已有蛋白質(zhì)或新合成一些蛋白質(zhì)，來(lái)維持正常的新陳代謝。這些植物度過(guò)低溫逆境的蛋白質(zhì)或多肽通稱(chēng)為植物低溫蛋白(cold-induccdproteins)。 甘薯是低溫敏感植物，在10℃以下時(shí)，甘薯的細(xì)胞原生質(zhì)活動(dòng)停滯

2、，生理機(jī)能受到影響，因而發(fā)生冷害。當(dāng)溫度在-2℃時(shí)，甘薯細(xì)胞間隙結(jié)冰，其組織被破壞，從而發(fā)生凍害。由于受冷害或凍害的薯塊生理作用異常，新陳代謝受到破壞，致使薯塊的貯藏性和抗病力降低，因而容易受病菌侵染。此外，在甘薯種苗生長(zhǎng)過(guò)程中，常常因?yàn)楹蓖蝗唤禍貙?dǎo)致凍害發(fā)生給生產(chǎn)帶來(lái)不可估量的損失。因此，培育抗凍甘薯新品種具有重要的應(yīng)用前景。 迄今已有8種黃粉蟲(chóng)抗凍蛋白的cDNA被鑒定，它們分別編碼84、96或102個(gè)氨基酸殘基。已有研究表

3、明，黃粉蟲(chóng)抗凍蛋白可以使溶液的冰點(diǎn)降低5.58℃，是已知所有抗凍蛋白中抗凍活性最高的。 本研究從冷誘導(dǎo)的黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)中提取總RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增得到一條全長(zhǎng)為339bp的cDNA片段。該片段編碼112氨基酸的包含信號(hào)肽(28個(gè)氨基酸)抗凍蛋白的完全編碼區(qū)序列。該蛋白成熟區(qū)是由7個(gè)由CTXSXXCXXAXT基序構(gòu)成的β-螺旋組成，富含Thr(17.55％)和Cys(18.74％)，能夠形成8個(gè)分子內(nèi)二硫鍵。 與Gcnb

4、ank上已有序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，我們克隆到的序列與已知Tmafpi4-9基因序列具有最高相似性，核酸同源性高達(dá)99％，氨基酸同源性高達(dá)96％。基因序列分析發(fā)現(xiàn)，與Tmafpi4-9基因相比，Tmafp1有第5位(G→C)，第44位(C→T)，第229位(G→A)和第318(A→T)位，共4個(gè)堿基發(fā)生變化，這種變化導(dǎo)致與THPi4-9相比，TmAFP1的第2位的甘氨酸殘基被丙氨酸殘基取代，第16位蘇氨酸殘基被異亮氨酸殘基取代，第76位的纈氨酸殘

5、基被蛋氨酸殘基取代，第1C7位蘇氨酸殘基被絲氨酸殘基取。利用Tmafp1序列構(gòu)建抗凍蛋白大腸桿菌原核表達(dá)質(zhì)粒載體，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)成功表達(dá)出預(yù)期大小的重組蛋白，該蛋白經(jīng)復(fù)性、純化后表現(xiàn)出了冰結(jié)合活性與體外抗凍活性。進(jìn)一步利用黃粉蟲(chóng)抗凍蛋白代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗凍保護(hù)劑DMSO制備的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，30μg/ml濃度下，重組抗凍蛋白制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率最高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明隨著蛋白濃度加大(大于40μg/ml)，轉(zhuǎn)化效率表現(xiàn)降低

6、趨勢(shì)，說(shuō)明抗凍蛋白的抗凍保護(hù)活性與濃度之間存在一定的負(fù)相關(guān)關(guān)系。保存時(shí)間對(duì)所制備的感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率沒(méi)有太大影響。在液氮和-80℃冰箱保存條件下，感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率變化不大，當(dāng)保存在-20℃冰箱中時(shí)，轉(zhuǎn)化效率很低。 為了解決甘薯塊根保存與幼苗生長(zhǎng)過(guò)程中凍害問(wèn)題，本研究利用本實(shí)驗(yàn)室克隆得到的甘薯塊根特異性啟動(dòng)子、CaMV35S啟動(dòng)子(組成型)、黃粉蟲(chóng)抗凍蛋白編碼區(qū)和農(nóng)桿菌質(zhì)粒載體分別成功構(gòu)建出了抗凍蛋白甘薯塊根特異表達(dá)質(zhì)粒載體和

7、抗凍蛋白植物表達(dá)質(zhì)粒載體，將分別用于甘薯塊根保存期間和幼苗生長(zhǎng)過(guò)程中的抗凍保護(hù)。目前，正利用上述兩種質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化甘薯材料，以期獲得抗凍甘薯材料。 植物的S-腺苷甲硫氨酸合成酶(s-adenosylmethionine synthetase， SAMS)是植物代謝中的1個(gè)關(guān)鍵酶，它的表達(dá)受到比如鹽脅迫、溫度脅迫、滲透壓脅迫等一些環(huán)境因子的誘導(dǎo)。本研究利用本實(shí)驗(yàn)室建立的甘薯冷脅迫抑制消減文庫(kù)中擴(kuò)增得到1個(gè)全長(zhǎng)為1182bp的甘薯SA