花生PEPC家族基因分析及反義PEPC1基因遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、植物油是人類日常生活所需要的主要營養(yǎng)物質(zhì)，也是重要的工業(yè)原料。由于人口增長、經(jīng)濟發(fā)展、農(nóng)產(chǎn)品消費結(jié)構(gòu)變化等因素的影響，使得國內(nèi)外植物油脂市場需求量驟增。目前我國植物油供需矛盾突出，自給率不足35％。提高油料作物的含油量是增加油脂產(chǎn)量的有效途徑?；ㄉ俏覈钪匾挠土献魑镏?，與大豆、油菜等主要油料作物相比，花生單位面積產(chǎn)油量最高?；ㄉN子含油量45-56%，具有進一步提高的潛力。
　　近年來，隨著花生基因組測序工作的開展、花生轉(zhuǎn)基

2、因技術(shù)的逐步完善，使得通過轉(zhuǎn)基因、分子育種手段培育高油花生品種成為可能。油脂合成和蛋白質(zhì)合成存在一定的競爭性，兩個代謝過程均需要利用磷酸烯醇式丙酮酸（Phosphoenolpyruvate, PEP）做底物。乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）催化丙酮酸合成乙酰-CoA，進入脂肪酸合成途徑，而磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（Phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC）可催化丙酮酸合成草酰乙酸，進入蛋白質(zhì)合成途徑。PE

3、PC在植物中具有多種生理功能，研究表明PEPC參與碳/氮吸收、脂肪酸調(diào)控并與鹽和干旱脅迫反應有關(guān)，但對其功能認識仍然非常有限。目前，花生中PEPC基因功能深入研究未見報道。本研究分析了花生PEPC家族基因的表達特性；在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建AhPEPC1基因的反向表達載體，轉(zhuǎn)化花生，通過對轉(zhuǎn)基因植株性狀分析，研究該基因在提高花生油脂含量中的作用及其分子機制。研究結(jié)果對于進一步提高花生含油量具有潛在的應用價值。
　　本研究取得以下結(jié)果：

4、r>　　1、通過氨基酸序列比對、保守結(jié)構(gòu)域分析、基因結(jié)構(gòu)預測以及系統(tǒng)發(fā)育進化分析等生物信息學分析方法，將花生PEPC家族5個基因分為兩類：AhPEPC1、AhPEPC2、AhPEPC3和 AhPEPC4基因編碼植物型 PEPC，AhPEPC5基因編碼細菌型 PEPC。AhPEPC1、AhPEPC2、AhPEPC3和AhPEPC4基因結(jié)構(gòu)由10個外顯子和9個內(nèi)含子組成；AhPEPC5基因結(jié)構(gòu)由20個外顯子和19個內(nèi)含子組成。
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5、、通過花生不同組織和不同發(fā)育時期的熒光定量 PCR分析，發(fā)現(xiàn) AhPEPC1、AhPEPC2、AhPEPC3、AhPEPC4和AhPEPC5基因在根、莖、葉和種子中均有表達但表達模式不同。AhPEPC1基因在種子中的表達量最高，AhPEPC3基因在根中的表達量較高，AhPEPC4基因在葉中的表達量較高。
　　3、將AhPEPC1基因片段反向連接植物雙元表達載體pCAMBIA1301，構(gòu)建獲得反義表達載體 pCAMBIA1301-P

6、EPC，農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化花生。經(jīng)潮霉素篩選后，利用特異引物 PCR檢測獲得陽性植株。表型觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因花生農(nóng)藝性狀未發(fā)生明顯改變，與對照花生相比，轉(zhuǎn)基因花生種子含油量提高了5.7%-10.3%，脂肪酸組分相對含量沒有變化，但種子蛋白質(zhì)含量降低了7.5%-17.0%，轉(zhuǎn)基因花生萌發(fā)過程中對鹽脅迫耐受性增強。
　　4、為了進一步分析轉(zhuǎn)基因花生中AhPEPC1基因的抑制表達是否影響其他基因的功能，對轉(zhuǎn)基因植株進行了轉(zhuǎn)錄組測序分析。結(jié)果表