人類線粒體基因組遺傳變異在精子生成中的作用及其機制.pdf

1、不孕不育是生殖健康領域一項亟需解決的重大科學問題。育齡夫婦中約10-15％存在不同程度的生育障礙。導致不孕不育的原因很多，其中男方因素約占50％。前人研究表明，在過去的半個世紀里，男性精液質量顯著下降，精子生成障礙已成為男性不育最常見的病因之一。精子生成障礙可能與環(huán)境化學污染物、遺傳因子改變、表觀遺傳修飾異常等密切相關。大約30％的精子生成障礙患者是由于遺傳學的異常引起的。線粒體作為細胞核外唯一含有遺傳物質的細胞器，其參與的氧化磷酸化過

2、程為精子生成、分化及活力維持提供所必需的能量。而且線粒體參與多種生物學過程，在ROS(Reactive Oxygen Species)平衡、細胞凋亡以及多種信號通路調節(jié)中都具有重要作用。線粒體基因組(Mitochondrial DNA，mtDNA)編碼氧化磷酸化體系的蛋白亞基和其自身的RNA翻譯元件，mtDNA變異會導致線粒體功能改變，進而引起精子生成障礙，導致男性不育。目前關于mtDNA遺傳變異對精子生成或精液質量的影響已有相關報導。

3、然而由于受到mtDNA變異檢測技術、樣本量大小以及種群差異等多種因素的限制，線粒體基因組遺傳變異對精子生成的影響也不盡相同。本研究分為三個部分：
　　第一部分：人類線粒體基因組遺傳變異在非梗阻性無精癥(NOA)發(fā)生中的作用。
　　目的：為了闡明人類線粒體基因組在非梗阻性無精癥(NOA)中的作用，我們對NOA不育男性與健康生育對照的線粒體全基因組進行測序，篩選與精子生成障礙相關的線粒體DNA遺傳變異，并在大樣本人群中進一步確認

4、。
　　方法：采用兩階段病例對照研究。第一階段，應用高通量測序技術對96例無精癥病例和96例對照進行mtDNA全測序，鑒定mtDNA單倍群，篩選出常見mtDNA單倍群以及與精子生成障礙相關的mtDNA遺傳變異。第二階段，針對536例無精癥病例和489例對照，利用SnaPshot測序技術，基于13個東亞地區(qū)常見單倍群的編碼區(qū)特征突變點分型結果，分析人群遺傳背景。隨后，利用SNPscan測序技術，對測序階段篩選出的遺傳變異進行驗證。為

5、了進一步闡明線粒體遺傳變異導致的線粒體損傷的機制，我們應用總抗氧化能力(total antioxidant capability,T-AOC)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒檢測并比較病例和對照以及不同單倍群之間精漿抗氧化能力。
　　結果：根據第一階段測序所得的線粒體DNA全序列，鑒定每個個體mtDNA單倍群分型，結合mtDNA系統發(fā)生樹以及東亞地區(qū)常見單倍群，篩選了13個東亞地區(qū)常見

6、單倍群及其定義位點，對比了病例和對照兩組間的遺傳背景。同時篩選了10個線粒體DNA潛在的功能性遺傳變異位點，包括6個編碼區(qū)的可能導致非同義突變的遺傳變異(m.3394T＞C，m.6881A＞G，m.8684C＞T, m.11696G＞A，m.12358A＞G，m.13135G＞A)，1個遺傳變異位于tRNA基因上(m.15968T＞C)，另外3個遺傳變異位于第一高變區(qū)(HVRI)(m.16224T＞C，m.16319G＞A，m.1649

7、7A＞G)。對第二階段大樣本獨立人群的遺傳背景進行分析，結果提示單倍群M8*在病例組的比例顯著高于對照組(OR2.61，95％ CI1.47-4.61)(P=6.76×10-4)，提示單倍群M8*會增加精子生成障礙的風險。此外，在獨立人群中驗證潛在遺傳變異位點，結果發(fā)現m.8684C＞T在病例組中顯著高發(fā)(OR4.14，95％ CI1.56-11.03)(P=2.09×10-3)，提示m.8684C＞T同樣會增加精子生成障礙的風險。同時

8、由于m.8684C＞T是單倍群M8a的遺傳標記位點，因此，我們進一步提出假設，遺傳背景單倍群M8a導致了遺傳變異m.8684C＞T在無精癥人群中富集。為了驗證上述假設，我們進一步分析單倍群M8*的2個亞單倍群，M8a和Z，比較單倍群M8a和單倍群Z在病例和對照之間的分布，發(fā)現單倍群M8a在病例組中的比例顯著高于對照組(OR4.14，95％ CI1.56-11.03)(P=2.09×10-3)，而單倍群Z在兩組間的分布并無顯著統計學差異(

9、OR1.86，95％ CI0.92-3.77)(P=7.88×10-2)。結果提示，遺傳背景單倍群M8a導致了遺傳變異m.8684C＞T在無精癥人群中富集，增加了其導致精子生成障礙的風險。為進一步研究線粒體遺傳變異致線粒體損傷的水平，我們對精漿抗氧化能力進行檢測。與對照組相比，病例組T-AOC顯著下降(P＜0.05)，提示病例組線粒體功能受損，而SOD活性沒有差異。在不同單倍群之間，由于樣本量的限制，T-AOC和SOD并沒有發(fā)現明顯差異

10、。
　　結論：遺傳背景單倍群M8a導致了遺傳變異m.8684C＞T在無精癥人群中富集，增加了其導致精子生成障礙的風險。同時，mtDNA遺傳變異可導致精漿抗氧化能力下降，提示線粒體損傷，從而能夠引起精子生成障礙。
　　第二部分：人類線粒體基因組遺傳變異在少弱精癥發(fā)生中的作用。
　　目的：為了全面研究線粒體基因組與少弱精癥病因學之間的關聯，通過深度測序線粒體全基因組，篩選與精液質量下降相關的線粒體DNA遺傳變異，并在獨立人

11、群中進行驗證。
　　方法：采用兩階段病例對照研究。篩選階段，采用下一代測序技術對233例少弱精癥病例和233例對照進行mtDNA全測序。鑒定樣本單倍群并分析主要單倍群分布。隨后，篩選與少弱精癥相關的線粒體基因組遺傳變異位點。驗證階段，針對688例少弱精癥患者及533例對照，利用SNaPshot測序方法，基于13個東亞地區(qū)常見的單倍群定義位點分型結果，分析mtDNA單倍群遺傳背景。利用SNPscan測序技術，對測序階段篩選的遺傳變異

12、進行驗證。
　　結果：根據篩選階段測序所得的線粒體DNA全序列，鑒定樣本單倍群并整合入13個東亞地區(qū)常見單倍群，分析少弱精癥和對照兩組的單倍群分布，結果符合東亞特有mtDNA單倍群的頻率分布。同時篩選出7個可能增加精液質量下降的風險的遺傳變異位點。其中，4個位點位于編碼區(qū)(m.12338T＞C，m.12361A＞G，m.13928G＞C和m.A15235 A＞G)，1個位點位于tRNA(m.5601C＞ T)，2個位點位于第一高變

13、區(qū)(m.16179 C＞T和m.16291 G＞A)。對驗證階段大樣本獨立人群的遺傳背景進行分析，發(fā)現少弱精癥組和對照組兩組間線粒體單倍群分布沒有統計學差異，提示兩組間遺傳背景的一致性。此外，通過獨立人群的驗證發(fā)現，位于第一高變區(qū)(HVS-Ⅰ)的潛在遺傳變異位點m.16179 C＞T與少弱精癥顯著相關(OR3.10，95％ CI1.41-6.79)(P=3.10×10-3)。為了進一步闡明線粒體遺傳變異對精液質量的影響，我們分析了精子密

14、度和精子活力兩個指標。m.16179 C＞T和m.12361 A＞G能顯著增加少精癥的風險，P值分別為1.90×10-4(OR4.18;95％ CI1.86-9.40)和5.50×10-3(OR3.30;95％ CI1.36-8.04)。m.16179 C＞T同時能顯著增加弱精癥的風險(OR3.17;95％ CI1.40-7.16)(P=3.50×10-3)。
　　結論：線粒體DNA遺傳變異m.16179 C＞T和m.12361

15、A＞G可以增加少弱精癥的發(fā)病風險。
　　第三部分：少弱精癥的線粒體基因組拷貝數變異研究。
　　目的：通過比較少弱精癥與健康生育男性對照精子mtDNA拷貝數水平，分析mtDNA含量與精液質量的關系，探討導致mtDNA拷貝數差異的可能原因
　　方法：利用實時熒光定量PCR技術，采用相對定量的方法，檢測100例少弱精癥病例和80例正常對照的精子mtDNA拷貝數。
　　結果：少弱精癥組的平均mtDNA拷貝數79.02±1