富勒烯新衍生物的合成、細胞毒性和放射細胞生物學活性研究.pdf

1、富勒烯(fullerene，C60)的出現為我們研究甲硝唑藥物載體打開了思路。本實驗利用富勒烯母體的載帶活性，合成C60載帶CMNa體內活性結構甲硝唑(metronidazole)的全新化合物C60-甲硝唑藥物復合體，以期提高藥物在腫瘤部位的濃度，有效增加藥物與血管壁的接觸時間和接觸面積，有助于藥物穿過血管壁，增加藥物的血管外分布和藥物作用的靶向性；通過光照與射線的序貫作用，增加DNA鏈斷裂，提高該藥物復合體的腫瘤細胞殺傷力，減輕放療副

2、作用。 另外，富勒烯母體本身的生物學效應研究遇到不少障礙，其中最大的障礙是它難溶于水，因此仍有許多基本問題尚未解決，如母體的細胞毒性。有學者通過接入不同衍生基團提高水溶性，但富勒烯衍生物的行為并不能代表富勒烯本身，功能基團的加入和極性的改變會使得富勒烯衍生物的生物行為與富勒烯本身相比可能會有不同的特點；且衍生物一旦進入體內參與各種化學反應和生物代謝時，將去除支鏈而轉變?yōu)槟阁w，這使得C60母體的生物學行為研究顯得更加重要，其生物學

3、特性可對衍生物的行為研究起到預測、指導作用。為此本實驗借助助溶劑將C60溶于水中形成C60-H2O溶膠混懸液，在細胞水平檢測驗證富勒烯母體對細胞的氧化損傷，探討其細胞毒性及相關機理；同時檢測富勒烯和富勒烯-甲硝唑衍生物的輻射細胞生物學活性，為開展該類化合物在放射生物學領域的應用提供理論和實驗依據。主要研究結果和討論如下： 1、富勒烯-甲硝唑(C60-Metronidazole)藥物復合體的合成 具有放射增敏作用的甲硝唑在

4、體內的活性基團為醇羥基和芳香硝基，為此我們嘗試以C60為載體，通過將醇羥基與酸成酯，或將醇羥基先鹵化再胺化，與酸縮和成酰胺，抑或將硝基還原成氨基后與酸縮和成酰胺，再與富勒烯母體相連形成藥物載體。但經過反復實驗，我們依照原設計路線合成富勒烯-甲硝唑衍生物時，反應并未得到所設想的攜載單個甲硝唑分子的化合物，而是中間體化合物NC2和NC3(見Fig.1.B，C)。通過甲硝唑先與丙二酸成酯，再與Fullerene[C60]發(fā)生[1+2]環(huán)加成反

5、應，從而將甲硝唑連接到Fullerene[C60]上，形成目標化合物C60-metronidazole復合體NC4(見Fig.1.D)，并通過紅外光譜(infraredspectroscopy，IR)、核磁共振氫譜(1Hnuclearmagneticresonance，1H-NMR)結構確認。NC5(見Fig.1.E)為反應的副產物，其結構和活性有待進一步檢測。 Fig.1富勒烯及其新衍生物2、富勒烯母體水溶膠(Nano-C60

6、)的制備及其不同衍生物的細胞毒性研究 由于很難溶于水，對富勒烯母體的生物學活性研究不多。本課題通過助溶劑四氫呋喃(tetrahydrofuran，THF)將富勒烯母體結合到水中形成一定濃度的C60水溶膠NC1(見Fig.1.A)，透射電子顯微鏡下觀察顆粒直徑約為10～100nm。所制備的富勒烯母體水溶膠又稱為Nano-C60，用于本課題關于富勒烯母體的細胞毒性實驗。 本研究采用的兩株細胞為B16和SMMC-7721。MT

7、T法顯示，在較高濃度范圍內(72μg/L～7200μg/L)，Nano-C60作用B16、SMMC-7721兩株細胞后，細胞增殖均受到明顯抑制，且隨濃度的增加抑制效應增強，但低濃度在一定的時間段內并無細胞毒作用；NC1的細胞毒性與化合物作用的時間和劑量相關，且不同細胞株對Nano-C60的毒性反應在相應的時間和劑量范圍內表現出一定的差異，細胞存活率下降至同一水平，較之B16，SMMC-7721需要相同濃度的NC1作用更長時間。NC1的細

8、胞毒性與光作用有關。 實驗發(fā)現，富勒烯母體在體外實驗產生的毒性可能與誘導細胞發(fā)生凋亡有關。結合普通光鏡和熒光顯微鏡Hoechst33258細胞染色觀察，從形態(tài)學上發(fā)現不同濃度的Nano-C60作用不同時間后能出現較明顯的細胞凋亡表現，但作用靶部位有所不同；通過AnnexinV/PI雙染檢測，NC1低濃度長時間作用的細胞改變以右下象限的早期凋亡為主，而較高濃度作用時間較短的細胞則突出表現為細胞膜損傷，即集中于右上象限晚期凋亡細胞為

9、主，各組有明顯差別(p＜0.01)。 另外，通過MTT法檢測富勒烯不同基團衍生物的細胞毒性發(fā)現，其毒性大小與側鏈結構有關。隨著富勒烯構架上衍生化基團的增多，細胞毒性趨于減輕。其中富勒烯母體NC1對SMMC-7721細胞毒性最強。 通過激光共聚焦及分光光度檢測，與對照組相比，B16細胞和SMMC-7721細胞經Nano-C60作用后細胞內產生的活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)增多，這可能是誘導細

10、胞發(fā)生凋亡引發(fā)細胞毒性的主要因素。另外細胞膜氧化損傷指標SOD(superoxidedismutase，超氧化物歧化酶)和MDA(malondialdehyde，丙二醛)檢測發(fā)現，在NC172μg/L作用細胞2～36小時SOD活力改變經歷了緩慢上升的過程，但到了48小時，SOD的活性明顯下降，這可能與細胞的應急抗氧化機制有關；MDA的量可反映機體內脂質過氧化(lipidperoxidation，LPO)的程度，B16細胞和SMMC-77

11、21細胞受較高濃度NC1作用后MDA也逐漸增高，可能與NC1誘導細胞內產生ROS有關。各種活性氧自由基會直接導致細胞發(fā)生包括膜損傷、凋亡等在內的各種損傷。 3、富勒烯及其衍生物的放射生物效應研究 富勒烯在發(fā)現之初，就表現出良好的光敏活性，但富勒烯母體及其衍生物是否在電離輻射作用下也表現出相似的活性尚是空白，為此本實驗進行C60水溶膠(NC1)以及新合成的C60-Metronidazole(NC4)的光毒性檢測，并結合γ射

12、線的作用觀察該類化合物的放射生物細胞學活性，比較NC1、NC4及其與藥物前體甲硝唑的細胞放射效應之間的差異。 首先比較了NC1和NC4的光毒性，形態(tài)學觀察和AnnexinV/PI染色表明，在光的激發(fā)下，相應濃度NC1和NC4促進細胞膜的損傷。由于側鏈的加入，NC4在光作用下的細胞抑制率低于母體NC1。再結合Y線照射，通過細胞克隆法和MTT發(fā)現，NC1和NC4光照與Y線照射效應之間存在著協同增強作用，相對于對照組，不同照射的序貫作

13、用能使細胞活存曲線下移；經過光照后再接受2GyY線照射的B16細胞的存活率，明顯低于單獨4GyY線照射的細胞存活率；且該作用與Y線照射時是否有化合物同存有關，保持一定濃度NC1作用即接受Y線照射的B16細胞，在照射劑量達8Gy以后表現出存活率下降趨緩；但NC4并無類似表現；光照、Y線照射之間的間隔時間越短，效應越明顯；此外與母體藥物metronidazole相比，一定照射劑量下，NC4作用的細胞受照后活存率下降更低，提示該藥物復合體的活

14、性較為理想，可能與藥物復合體中的富勒烯成份使metronidazole聚集有關；激光共聚焦顯微鏡下用DCFH-DA探針(2,7-dichlorofluoresceindiacetate2'，7'-雙乙酸鹽二氯熒光素)檢測ROS的含量變化，NC1和NC4在光和Y輻射下的活性與B16細胞內生成更多的ROS有關；CometAssay檢測發(fā)現，NC1和NC4能促進Y線照射后引起的DNA損傷并抑制其修復，NC4比NC1的抑制作用更強；連同化合物一

15、起照射的B16細胞，由于滯留細胞內的化合物結構上可能與抑制DNA損傷修復的某些酶的活性部位相似，通過影響潛在性致死損傷和亞致死損傷的修復而增加DNA損傷。 總之，本實驗合成了富勒烯全新衍生物富勒烯-甲硝唑復合體并制備了富勒烯母體水溶膠，初步從細胞水平檢測其光毒性，同時結合Y電離輻射和不同光照條件，觀察其潛在的光敏/放敏活性，豐富了富勒烯及其衍生物的生物活性內容，為更好地將富勒烯用于醫(yī)學和生物學提供一定的實驗依據。水溶性富勒烯及其