攜帶抑菌基因IL-24的rDNA區(qū)靶向載體對MSCs打靶的初步探索.pdf

1、隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人類對于DNA重組技術(shù)的認識逐漸成熟，腫瘤基因治療作為治療腫瘤的新手段應(yīng)運而生。在腫瘤基因治療中，載體以及運輸細胞的選擇尤為關(guān)鍵。我室一直致力于安全，高效的非病毒載體的研究與開發(fā)，在前期研究中已經(jīng)成功構(gòu)建了針對腫瘤基因治療的載體:pHrneo-IL24。在靶細胞的選擇上，MSCs具有向腫瘤位置遷移和趨近的能力，并且易于分離，可分化為多種細胞，有報道表明MSCs已應(yīng)用于腫瘤治療的臨床前試驗。MSCs的靶向基因修飾可進

2、一步促進其在腫瘤基因治療中的療效，但MSCs的基因修飾一直是個技術(shù)難題，靶向基因編輯技術(shù)——核酸工程酶TALEN的出現(xiàn)為突破此難題提供了良好的工具。因此，本研究擬結(jié)合TALENickases（我室已建立的TALEN高效突變體），利用攜帶IL-24的核糖體基因區(qū)靶向載體pHrneo-IL24對MSCs進行基因打靶，以期得到穩(wěn)定表達有生物學(xué)活性IL-24蛋白的定點整合克隆。
　　目的:使用pHrneo-IL24載體系統(tǒng)聯(lián)合TALENi

3、ckases打靶MSCs，以期得到穩(wěn)定表達IL-24的MSC細胞株。
　　方法:1.MSCs的分離與培養(yǎng):從骨髓標本中分離骨髓中的單核細胞，再用貼壁培養(yǎng)分離出骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)。2.流式鑒定擴大培養(yǎng)的MSCs表面標志物。3.將TALENickases以及pHrneo-IL24質(zhì)粒通過核轉(zhuǎn)，共轉(zhuǎn)染至MSCs，鏡下通過觀察融合的GFP蛋白表達，分析轉(zhuǎn)染效率。4、轉(zhuǎn)染后細胞分兩線接種，一線加入G418篩選定點整合克隆，另一線直

4、接擴增培養(yǎng)。5.抽提打靶后細胞gDNA，定點整合PCR鑒定rDNA區(qū)整合細胞。6.收集打靶后細胞上清，ELISA檢測細胞克隆IL-24蛋白的表達量。
　　結(jié)果:1.從骨髓標本中分離出的MSCs呈短梭形，形態(tài)規(guī)整，數(shù)次傳代后，呈成纖維狀，流式結(jié)果顯示符合MSCs的各項表面標志物表達;2.核轉(zhuǎn)后的MSCs鏡下可見綠色熒光表達，G418篩選后的細胞大量死亡，未得到定點整合的單克隆細胞。3.擴增未加G418篩選的轉(zhuǎn)染后MSCs，抽提gDN