促炎癥消退介質脂氧素對內毒素性肺損傷的保護作用及機制.pdf

1、第一部分 脂氧素對脂多糖誘導小鼠巨噬細胞鈣信號轉導及活性氧產生的影響及機制
　　 目的：研究脂氧素對脂多糖誘導的小鼠RAW264.7 巨噬細胞鈣信號轉導及活性氧產生的影響并探討其可能機制。
　　 方法：小鼠RAW264.7 巨噬細胞，隨機分為6組：①對照組；②單純lipopolysaccharide (LPS)組：以終濃度2-10 μg/ml LPS 刺激巨噬細胞；③單純Thapsigargin(鈣池操縱的鈣通道激活劑)

2、組：以終濃度2 μM Thapsigargin刺激巨噬細胞；④脂氧素++LPS組：分別用終濃度為10-7、10-8或10-9M的脂氧素預處理，再以LPS(2-10 μg/ml)刺激；⑤脂氧素+Thapsigargin組：分別用終濃度為10-7、10-8或10-9M的脂氧素預處理，再以2 μM Thapsigargin 刺激；⑥2-Aminoethoxydiphenylborate(2-APB，鈣池操縱的鈣通道阻滯劑)+Thapsigar

3、gin組：20 μM 2-APB 預處理，再以2 μM Thapsigargin 刺激。采用細胞內鈣離子特異性熒光探針Fluo3-AM和活性氧特異性熒光探針DCFH-DA 標記小鼠巨噬細胞。激光共聚焦顯微鏡動態(tài)觀察脂多糖引起巨噬細胞胞內游離鈣濃度變化，流式細胞儀測定巨噬細胞活性氧產生變化。
　　 結果：脂多糖呈劑量依賴升高細胞內游離鈣濃度和活性氧的產生，鈣池操縱的鈣通道激活劑Thapsigargin 可完全抑制脂多糖引起的胞內鈣

4、超載。脂氧素呈劑量依賴抑制脂多糖引起的胞內游離鈣濃度升高，脂氧素同時可抑制Thapsigargin 激活鈣池操縱的鈣通道引起的鈣內流。細胞外無鈣液及脂氧素均可抑制脂多糖和Thapsigargin 誘導的活性氧產生。結論脂多糖通過促進內鈣釋放而開放鈣池操縱的鈣通道，大量細胞外鈣離子進入細胞使鈣超載，活性氧大量產生，引起組織細胞損傷。脂氧素可能通過抑制鈣池操縱的鈣通道，使外鈣內流減少，保持細胞鈣穩(wěn)態(tài)，減少活性氧的生成而起到抗炎促炎癥消退作用

5、。目的研究脂氧素對脂多糖誘導的小鼠RAW264.7 巨噬細胞TNF-α轉化酶表達的影響。方法小鼠RAW264.7 巨噬細胞，隨機分為3組：①對照組；②單純LPS組：以終濃度1-2 μg/ml LPS 刺激巨噬細胞；③脂氧素++LPS組：分別用終濃度為10-7、10-8或 10-9M的脂氧素預處理，再以LPS(1-2 μg/ml)刺激。孵育6小時和24小時后，收集細胞上清液，酶聯(lián)免疫法測定上清液TNF-α濃度。提取細胞總mRNA,RT-P

6、CR測定TNF-α轉化酶和TNF-α基因表達，提取細胞總蛋白測定TNF-α轉化酶蛋白表達，流式細胞儀檢測膜型TNF-α蛋白表達。結果脂氧素抑制脂多糖誘導的RAW264.7小鼠巨噬細胞TNF-α基因和膜型TNF-α蛋白表達。脂氧素抑制脂多糖誘導的TNF-α轉化酶蛋白表達但不影響其mRNA 表達，并呈劑量依賴抑制脂多糖誘導的分泌型TNF-α產生。
　　 結論：脂氧素通過干擾TNF-α轉化酶蛋白質翻譯過程，進而減少脂多糖誘導的RAW2

7、64.7 巨噬細胞分泌型TNF-α的產生，這可能是脂氧素抗炎促炎癥消退的重要作用機制之一。
　　 第二部分 脂氧素對脂多糖誘導小鼠巨噬細胞TNF-α 轉化酶的影響
　　 目的：研究脂氧素對脂多糖誘導小鼠急性肺損傷的影響并探討其可能機制。
　　 方法：36 只雄性C57BL/6小鼠，隨機分為6組(n =6)：①對照組：小鼠霧化吸入0.9[％]生理鹽水20 min，60 min 后尾靜脈注射10[％]乙醇5 ml/k

8、g；②脂氧素組：小鼠霧化吸入 0.9[％]生理鹽水20 min，60 min 后尾靜脈注射脂氧素(0.1 mg/kg)；③ ZnPP組：小鼠霧化吸入0.9[％]生理鹽水20 min，60 min 后尾靜脈注射Zinc protoporphyrinIX(血紅素氧合酶-1 抑制劑)25 mg/kg；④ LPS組：小鼠霧化吸入LPS 20 min，60 min后尾靜脈注射10[％]乙醇 5 ml//kg；⑤脂氧素治療組：以脂氧素0.1 mg/

9、kg 代替乙醇，其余處理同LPS組；⑥ ZnPP＋＋脂氧素治療組：處理同脂氧素治療組，但靜脈注射脂氧素30 min前注射ZnPP 25 mg/kg。霧化吸入LPS 或生理鹽水后8 h處死動物。光鏡下觀察肺組織病理學變化，測定肺泡灌洗液白細胞、中性粒細胞計數(shù)和TNF-α含量及總蛋白濃度；測定肺組織髓過氧化物酶(MPO)活性、干濕重比值、丙二醛(MDA)活性和一氧化氮(NO)濃度；測定肺組織血紅素氧合酶-1(HO-1)的蛋白表達和活性。

10、r>　　 結果：與 LPS組比較，脂氧素治療組肺組織中性粒細胞浸潤減少、肺水腫減輕，肺組織MPO 活性、MDA 活性、NO 含量、TNF-α濃度均降低(P＜0.01)，肺泡灌洗液總蛋白濃度降低(P＜0.01)。而HO-1的蛋白表達和活性明顯升高，HO-1 抑制劑ZnPP 減弱脂氧素保護作用。
　　 結論：脂氧素通過上調HO-1 減輕內毒素誘導的小鼠急性肺損傷。
　　 第三部分脂氧素對內毒素性肺損傷小鼠的保護作用及機制<

11、br>　　 目的：研究脂氧素對脂多糖誘導小鼠急性肺損傷的影響并探討其可能機制。
　　 方法：36只雄性C57BL/6小鼠，隨機分為6組((n=6):①對照組:小鼠霧化吸入0.9[％]生理鹽水20min，60min后尾靜脈注射10[％]乙醇5 ml/kg;②脂氧素組:小鼠霧化吸入0.9[％]生理鹽水20 min，60 min后尾靜脈注射脂氧素(0.1 mg/kg);③ZnPP組:小鼠霧化吸入0.9[％]生理鹽水20 min,60

12、min后尾靜脈注射血紅素氧合酶-1抑制劑25 mg/kg;④LPS組:小鼠霧化吸入LPS 20min，60min后尾靜脈注射10[％]乙醇5 ml/kg;⑤脂氧素治療組:以脂氧素0.1 mg/kg代替乙醇，其余處理同LPS組:⑥ZnPP+脂氧素治療組:處理同脂氧素治療組，但靜脈注射脂氧素30 min前注射ZnPP 25 mg/kg。霧化吸入LPS或生理鹽水后8h處死動物。光鏡下觀察肺組織病理學變化，測定肺泡灌洗液白細胞、中性粒細胞計數(shù)和

13、TNF-α含量及總蛋白濃度:測定肺組織髓過氧化物酶(MPO)活性、干濕重比值、丙二醛(MDA)活性和一氧化氮(NO)濃度:測定肺組織血紅素氧合酶-1的蛋白表達和活性。
　　 結果：與LPS組比較，脂氧素治療組肺組織中性粒細胞浸潤減少、肺水腫減輕，肺組織MPO活性、MDA活性、NO含量、TNF-。濃度均降低(P＜0.01)，肺泡灌洗液總蛋白濃度降低(P<0.01)。而HO-1的蛋白表達和活性明顯升高，HO-1抑制劑ZnPP減弱脂氧