飛蝗三個(gè)P450基因的分子特性及功能分析.pdf

1、飛蝗是我國(guó)的重大農(nóng)業(yè)害蟲，其引發(fā)的蝗災(zāi)對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成很大的威脅。目前最主要的防治方法仍是化學(xué)防治。化學(xué)農(nóng)藥的施用使飛蝗產(chǎn)生了一定程度的抗藥性，細(xì)胞色素P450是昆蟲體內(nèi)的一類解毒酶系，目前認(rèn)為與抗藥性相關(guān)的P450基因多集中于CYP4、CYP6和CYP9家族中。本文以飛蝗為研究對(duì)象，經(jīng)分離克隆獲得三個(gè)細(xì)胞色素P450基因，進(jìn)而系統(tǒng)地研究了其分子特性和對(duì)殺蟲劑的解毒功能，為飛蝗的有效防治和抗藥性研究提供了理論依據(jù)。本文主要研究?jī)?nèi)容如下:<

2、br>　　一、飛蝗三個(gè)細(xì)胞色素P450基因的克隆和序列分析
　　基于飛蝗表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，采用生物信息學(xué)方法搜索得到細(xì)胞色素P450基因序列，經(jīng)Blast分析，選取CYP4、CYP6和CYP9家族各一條序列進(jìn)行了深入研究。通過生物信息學(xué)比對(duì)方法發(fā)現(xiàn)，CYP6和CYP9家族基因cDNA序列已經(jīng)具備了全長(zhǎng)序列的基本保守區(qū)，而CYP4家族序列為部分片段，需要進(jìn)一步獲取全長(zhǎng)序列。采用RACE-PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，從而

3、獲得CYP4家族基因的5'端序列。進(jìn)一步對(duì)三個(gè)細(xì)胞色素P450基因的全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證后的全長(zhǎng)序列提交國(guó)際細(xì)胞色素P450命名委員會(huì)，分別將其命名為CYP4G62、CYP6EL1和CYP9AQ1。與果蠅中CYP4、CYP6和CYP9家族全部基因進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明:CYP4G62全長(zhǎng)1992bp，包含1662bp開放閱讀框，66bp5'和264bp3'非編碼區(qū);CYP6EL1全長(zhǎng)2103bp，其中1503bp為開放閱讀框，

4、84bp5'和489bp3'非編碼區(qū);CYP9AQ1全長(zhǎng)2103bp，包含1578bp開放閱讀框，57bp5'和935bp3'非編碼區(qū)。三個(gè)P450基因的分子量分別為63.5、58.0和60.4kDa。等電點(diǎn)分別為6.80、6.84和7.20。
　　二、飛蝗三個(gè)P450基因的mRNA表達(dá)模式
　　采用Real-timePCR技術(shù)檢測(cè)了細(xì)胞色素P450基因在飛蝗不同組織部位的表達(dá)。結(jié)果顯示:CYP4G62主要在肌肉和脂肪體中表

5、達(dá)，CYP6EL1主要在中腸、胃盲囊和脂肪體中表達(dá)，CYP9AQ1主要在腦和脂肪體中表達(dá)。進(jìn)一步檢測(cè)飛蝗不同發(fā)育階段細(xì)胞色素P450基因的表達(dá)，結(jié)果表明:CYP4G62和CYP9AQ1在若蟲期的表達(dá)量最高，且隨著齡期的增加呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，在五齡若蟲時(shí)表達(dá)量最高，成蟲期表達(dá)量急劇下降;CYP6EL1在卵中表達(dá)量最高，其它各齡期表達(dá)量均較低。選取不同濃度的農(nóng)藥點(diǎn)滴處理飛蝗，發(fā)現(xiàn)馬拉硫磷可以不同程度地誘導(dǎo)三個(gè)細(xì)胞色素P450基因的表達(dá)，而西維

6、因?qū)θ齻€(gè)細(xì)胞色素P450基因的表達(dá)沒有影響。
　　三、飛蝗三個(gè)P450基因的生物學(xué)功能研究
　　為了進(jìn)一步研究飛蝗三個(gè)細(xì)胞色素P450基因的生物學(xué)功能，采用RNA干擾(RNAi)技術(shù)，將體外合成的雙鏈dsRNA注入飛蝗體內(nèi)，進(jìn)一步點(diǎn)滴農(nóng)藥，研究其對(duì)農(nóng)藥的敏感性。結(jié)果顯示:飛蝗體內(nèi)注入dsCYP6EL1和dsCYP9AQ1后點(diǎn)滴毒死蜱，與對(duì)照相比，其死亡率分別增加了29.35％和17.35％;點(diǎn)滴西維因后，死亡率分別增加19.

7、94％和31.04％。飛蝗體內(nèi)注射dsCYP4G62、dsCYP6EL1和dsCYP9AQ1后分別點(diǎn)滴溴氰菊酯，其死亡率分別增加26.88％、33.78％和20.53％。表明CYP4G62、CYP6EL1和CYP9AQ1對(duì)溴氰菊酯具有一定的解毒作用，同時(shí)CYP6EL1和CYP9AQ1對(duì)毒死蜱和西維因有解毒作用，但三個(gè)細(xì)胞色素P450基因?qū)︸R拉硫磷和DDT均無解毒功能。
　　本文以飛蝗為研究材料，通過克隆獲得三個(gè)細(xì)胞色素P450基因