涼血化瘀方對(duì)缺氧狀態(tài)下人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增生及VEGF表達(dá)的研究.pdf

1、通過建立體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞模型，觀察缺氧對(duì)該細(xì)胞的影響；采用唐由之研究員經(jīng)驗(yàn)方?jīng)鲅龇阶鳛楦深A(yù)藥物，觀察不同濃度的涼血化瘀方中藥及服用了不同劑量涼血化瘀方中藥的大鼠血清對(duì)缺氧狀態(tài)下人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增生及VEGF表達(dá)的影響。從分子生物學(xué)及血清藥理學(xué)的角度探討年齡相關(guān)性黃斑變性中藥治療的療效機(jī)制，為中醫(yī)中藥治療年齡相關(guān)性黃斑變性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1、用胰酶消化法分離、培養(yǎng)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，免疫細(xì)胞

2、化學(xué)法對(duì)其進(jìn)行鑒定。觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)過程及凍存、復(fù)蘇狀況。 2、用CoCl<,2>建立細(xì)胞化學(xué)缺氧模型，采用MTT法及WST-8法觀察缺氧對(duì)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增生的影響。 3．WST-8法觀察不同濃度涼血化瘀方中藥和服用了不同劑量涼血化瘀方中藥的大鼠血清對(duì)缺氧狀態(tài)下人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增生的影響。 4．采用ELISA法檢測(cè)不同濃度涼血化瘀方中藥和服用了不同劑量涼血化瘀方中藥的大鼠血清對(duì)缺氧狀態(tài)下人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)

3、胞培養(yǎng)上清VEGF含量的影響。 結(jié)果： 1、在原代細(xì)胞培養(yǎng)中，新鮮分離的RPE原代細(xì)胞在體外1～3d即可貼壁伸展，7～8d后，逐漸出現(xiàn)細(xì)胞集落，10～12d大部分培養(yǎng)瓶底部細(xì)胞呈融合狀態(tài)。隨著傳代次數(shù)增加，胞漿內(nèi)的黑色素顆粒逐漸減少直至消失，細(xì)胞形態(tài)呈梭形或不規(guī)則形，類似成纖維細(xì)胞。復(fù)蘇細(xì)胞的存活率可達(dá)90％以上，相差倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)與凍存前相比無明顯差異。免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，CK陽性，S100陽性。

4、2、用CoCl<,2>建立RPE細(xì)胞化學(xué)缺氧模型，采用MTT法和WST-8法檢測(cè)細(xì)胞活性，結(jié)果顯示：終濃度為1mMol/L CoCl<,2>濃度過高，影響細(xì)胞活性，抑制細(xì)胞增殖。終濃度為1uMol/L、10uMol/L、100uMol/L CoCl<,2>培養(yǎng)的RPE細(xì)胞均明顯增殖，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且其增生程度呈濃度依賴性，其中終濃度為100uMol/L CoCl<,2>培養(yǎng)的RPE細(xì)胞增殖最明顯，P<0.01。 3、觀察涼血化

5、瘀方中藥對(duì)RPE細(xì)胞的影響，結(jié)果顯示：終濃度為20mg/ml以上的涼血化瘀方中藥影響RPE細(xì)胞的活性。 4、采用涼血化瘀方中藥觀察其對(duì)缺氧狀態(tài)下人RPE細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示：終濃度為2mg/ml、200ug/ml的中藥抑制了缺氧狀態(tài)下人RPE細(xì)胞的增殖，且高濃度比低濃度更能明顯抑制人RPE細(xì)胞的增殖，P<0.01。 5、觀察服用了不同劑量涼血化瘀方中藥的大鼠血清對(duì)缺氧狀態(tài)下人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞增生的影響，結(jié)果顯示：缺氧條件下

6、，10％、20％、40％大劑量含中藥鼠血清及20％中劑量含中藥鼠血清均抑制了缺氧狀態(tài)下人RPE細(xì)胞的增生，且其抑制程度呈濃度依賴性。 6、用ELISA法檢測(cè)不同濃度的涼血化瘀方中藥對(duì)缺氧狀態(tài)下人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清VEGF含量的影響，發(fā)現(xiàn)加入終濃度為2ug/ml、20ug/ml、200ug/ml和2mg/ml的涼血化瘀方中藥均降低了缺氧狀態(tài)下RPE細(xì)胞培養(yǎng)上清中VEGF的含量，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，P<0.01。同時(shí)檢測(cè)服用

7、了不同劑量涼血化瘀方中藥的大鼠血清對(duì)缺氧狀態(tài)下人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清VEGF含量的影響，發(fā)現(xiàn)缺氧條件下，5％中、大劑量含中藥鼠血清及10％、20％、40％各組劑量含中藥血清培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞上清中VEGF含量均明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異，P<0.01。 結(jié)論： 1.正常人RPE細(xì)胞的體外培養(yǎng)、凍存及復(fù)蘇模式的建立，可為研究與RPE相關(guān)的眼底疾病的發(fā)病機(jī)制提供較好的體外細(xì)胞模型。 2.缺氧能引起RPE細(xì)胞顯著