鹽酸多奈哌齊對血管性癡呆小鼠海馬細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶表達變化的影響.pdf

1、目的：血管性癡呆(vascular dementia，VD)是因腦血管疾病所致的智能及認(rèn)知功能障礙臨床綜合征。隨著世界人口老齡化和疾病譜的變化以及對疾病診斷水平的不斷提高，VD的發(fā)病呈現(xiàn)明顯增長趨勢，越來越嚴(yán)重地威脅著老年人的身心健康，給社會和家庭帶來沉重的精神和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。世界衛(wèi)生組織已將此病列為21世紀(jì)的重點研究項目。目前，VD的發(fā)病機制尚不十分清楚，因此，探討VD發(fā)病機制、在治療原發(fā)病的基礎(chǔ)上加用促智藥物有望更好改善VD患者的生存質(zhì)

2、量。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)家族中的重要成員，最初被認(rèn)為和細(xì)胞的生長、發(fā)育、分化有關(guān)，最近研究表明，ERK信號通路與學(xué)習(xí)記憶有密切關(guān)系。眾所周知，血管性癡呆的重要表現(xiàn)之一是學(xué)習(xí)和記憶障礙，海馬是學(xué)習(xí)、記憶的重要結(jié)構(gòu)，那么，在VD小鼠的海馬組織中，ERK具有怎

3、樣的變化，目前尚未見報導(dǎo)。本研究通過建立血管性癡呆動物模型，觀察其海馬ERK1、ERK2及p-ERK(ERK的活性形式)的表達變化，以及觀察促智藥物中樞型膽堿酯酶抑制劑——鹽酸多奈哌齊(donepezil hydrochloride)對他們的影響，在揭示了VD發(fā)病機制的同時也為臨床用藥提供了理論基礎(chǔ)。 方法：本研究分為二部分。第一部分以昆明小鼠為研究對象，采用雙側(cè)頸總動脈絲線結(jié)扎方法、經(jīng)連續(xù)三次反復(fù)缺血.再灌注，制備VD模型，并

4、設(shè)立假手術(shù)組、藥物組(鹽酸多奈哌齊組)；造模術(shù)后第29、30天，利用跳臺試驗和水迷宮試驗裝置對各組小鼠分別進行學(xué)習(xí)和記憶成績測試，并觀察各組小鼠行為學(xué)差異。第二部分以4％多聚甲醛溶液固定的小鼠腦組織為研究對象，采用免疫組織化學(xué)方法進行染色，運用Image-Pro Plus圖象分析軟件對各組小鼠海馬組織CA1區(qū)相同面積內(nèi)ERK1和ERK2的陽性細(xì)胞進行計數(shù)，并測定陽性細(xì)胞的平均光密度；對各組小鼠海馬組織CA3區(qū)p-ERK的表達進行平均光密

5、度測定，運用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，采用LSD-t檢驗進行3組間的兩兩比較，以P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果：(1)跳臺試驗：模型組小鼠學(xué)習(xí)、記憶成績顯著下降，表現(xiàn)為學(xué)習(xí)階段的反應(yīng)時間延長(P<0.05)、錯誤次數(shù)增加(P<0.05)，記憶階段的潛伏時間縮短(P<0.05)、錯誤次數(shù)增加（P<0.05)；藥物組較模型組學(xué)習(xí)、記憶成績明顯改善(P<0.05)，并且與假手術(shù)組比較無顯著差別(P>0.05)

6、。(2)水迷宮試驗：模型組小鼠學(xué)習(xí)、記憶成績也顯著下降，表現(xiàn)為學(xué)習(xí)階段的游全程時間延長和錯誤次數(shù)增加(P<0.05)，記憶階段的游全程時間延長和錯誤次數(shù)增加(P<0.05)；藥物組較模型組明顯改善(P<0.05)，并且與假手術(shù)組之間無顯著差別(P>0.05)。(3)海馬HE染色：假手術(shù)組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列較致密整齊，核大而圓，核仁明顯；相比之下，VD模型組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列松散，層次不清，有細(xì)胞缺失現(xiàn)象，出現(xiàn)炎性細(xì)胞

7、浸潤，胞體變小，核固縮，胞質(zhì)濃染；藥物組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列尚整齊，未發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，核固縮現(xiàn)象較少見。(4)海馬CA1區(qū)ERK1、ERK2的表達變化：在光鏡下，假手術(shù)組海馬CA1區(qū)層次清楚，有大量陽性神經(jīng)元，陽性物質(zhì)主要位于胞膜及胞漿內(nèi)，細(xì)胞排列緊密，呈棕黃色，胞體較大，圓形或橢圓形，有的可見突起；而模型組陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，排列松散，胞體變小，核固縮；藥物組可見陽性神經(jīng)元數(shù)目較模型組增多，排列較致密，胞體變大。經(jīng)統(tǒng)計分

8、析發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠海馬CA1區(qū)相同面積內(nèi)ERK1、ERK2的陽性細(xì)胞數(shù)降低，陽性細(xì)胞平均光密度降低(P<0.05)；而藥物組ERK1、ERK2的陽性細(xì)胞數(shù)增加，陽性細(xì)胞平均光密度增加，與模型組比較有顯著差別(P<0.05)，與假手術(shù)組之間無顯著差別(P>0.05)。(5)海馬CA3區(qū)p-ERK的表達情況：p-ERK陽性部位主要位于CA3區(qū)輻射層(樹突)，假手術(shù)組免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物呈棕褐色，染色較深，樹突稠密，側(cè)支豐富；而模

9、型組免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物染色較淡，樹突稀疏，側(cè)支較少，平均光密度低于假手術(shù)組(P<0.05)；藥物組較模型組明顯好轉(zhuǎn)(P<0.05)，并且與假手術(shù)組無顯著差別(P>0.05)。 結(jié)論：(1)本實驗成功地建立了VD小鼠模型，經(jīng)跳臺試驗、水迷宮試驗證實了VD小鼠存在學(xué)習(xí)和記憶功能障礙，能夠基本模擬臨床上VD的智能障礙，海馬HE染色顯示錐體細(xì)胞受損，是比較理想的VD動物模型；同時，也證實了鹽酸多奈哌齊的治療效果。(2)采用免疫組織化學(xué)方法