釀酒酵母表達免疫活性小肽及其在魚類養(yǎng)殖中的效應研究.pdf

1、免疫活性肽(Immunopeptide)不僅在體外培養(yǎng)情況下刺激機體淋巴細胞的增殖、增強巨嗜細胞的吞噬能力，還能在生物體內(nèi)起重要的免疫調(diào)節(jié)作用，增強機體的免疫力，提高對外界病原物質(zhì)感染的抵抗能力。本論文根據(jù)糜蛋白酶專一酶切位點，對Val-Glu-Pro-Ile-Pro-Tvr、Gly-Leu-Phe等8個免疫活性小肽進行拼接，設計出具有刺激免疫活性的雜合肽；并分別在其C-末端和N-末端添加起始密碼子ATG和釀酒酵母強終止密碼子TAA，以

2、保證小肽蛋白的正確表達。為便于免疫活性肽表達后的分離和檢測，在小肽序列的N-末端添加了6個His的標簽。然后，根據(jù)釀酒酵母(S．cerevisiae)偏愛密碼子，設計出對應的DNA序列。設計得到的DNA序列含有表達為蛋白質(zhì)所需的所有要素，命名為免疫活性小肽基因IMP。 IMP基因分兩部分進行DNA序列合成，并通過PCR擴增、EcoR I酶切和連接，獲得了IMP基因全序列。通過BglⅡ酶切位點將IMP基因克隆至穿梭質(zhì)粒載體pMA9

3、1，獲得重組載體pMA91-IMP，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，經(jīng)PCR檢測、酶切鑒定及測序，確認所得到的IMP基因與我們設計的基因序列完全一致，且基因插入載體的方向正確。 將重組表達載體pMA91-IMP經(jīng)LiAc/ssDNA/PEG法轉(zhuǎn)化入釀酒酵母宿主菌H158中。通過亮氨酸營養(yǎng)缺陷型YNB培養(yǎng)基篩選出轉(zhuǎn)化子，并通過菌落PCR進行進一步的篩選和鑒定。根據(jù)設計在小肽序列N-末端的His-tag，應用Ni-NTA His.Bind樹

4、脂對表達的免疫活性肽進行富集，進而進行SDS-PAGE電泳檢測。結(jié)果表明免疫小肽基因IMP在酵母中得到表達。 采用不同的培養(yǎng)時間、初始pH值、葡萄糖濃度、溫度，通過搖瓶培養(yǎng)進行轉(zhuǎn)基因酵母表達條件優(yōu)化。在搖瓶優(yōu)化發(fā)酵條件的基礎上，用10 L發(fā)酵罐進行擴大培養(yǎng)。轉(zhuǎn)基因酵母發(fā)酵后經(jīng)離心濃縮，分兩個階段投喂大菱鲆(Scophthatmus maximus L.)幼苗，檢測免疫活性肽對魚苗抗病力、成活率和生長的影響情況。 第一階段

5、為魚苗孵出后6到20天左右，這一階段是喂養(yǎng)管理的關鍵時期，仔魚由內(nèi)源性營養(yǎng)向外源性營養(yǎng)轉(zhuǎn)化，死亡率較高，也是大菱鲆苗種培育過程中損失最嚴重的一個時期；先用轉(zhuǎn)基因酵母H158(pMA91-IMP)強化投喂輪蟲，再用強化后的輪蟲投喂魚苗。第二階段為魚苗孵出20天，可攝食顆粒飼料后，把轉(zhuǎn)基因酵母H158(pMA91-IMP)直接作為飼料添加劑進行投喂。 經(jīng)過兩個多月的分組投喂實驗，發(fā)現(xiàn)實驗組魚苗的成活率與體長比對照組明顯增加，其中“實