Astrocyte elevated gene-1對腎母細胞瘤生物學行為的影響及分子機制研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　腎母細胞瘤，又稱Wilms瘤，約占所有兒童腫瘤的比例為8％，是兒童比較常見的惡性腫瘤，同時也是兒童泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤。近些年來，雖然經(jīng)過手術、化療、放療等綜合治療，腎母細胞瘤的生存率有所提高，但仍有部分患兒由于復發(fā)、轉移以及對化療藥物的不敏感導致治療效果不佳而死亡。因此，探討腎母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展機制，尋找腎母細胞瘤的分子生物學標記物，具有重要的意義。
　　Astrocyte elevated g

2、ene-1(AEG-1)是Su等在2002年首次克隆出來的新基因，最早發(fā)現(xiàn)于感染HIV病毒的PHFA(primary human fetal astrocytes)細胞。近年來對AEG-1的深入研究，發(fā)現(xiàn)AEG-1能激活多條信號轉導通路，如PI3K/AKT、NF-κB、MEK/ERK、WNT/β-catenin等，與腫瘤的增殖、侵襲、轉移、血管生成、抗凋亡、耐藥等密切相關。盡管在多種體外培養(yǎng)的腫瘤細胞如胃癌、食管癌、肝細胞肝癌、惡性神經(jīng)

3、膠質瘤、神經(jīng)母細胞瘤、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、黑色素瘤、腎細胞癌及前列腺癌等以及多種腫瘤組織標本中都發(fā)現(xiàn)AEG-1表達顯著升高并對其機制進行了研究，但是，AEG-1與腎母細胞瘤中的相關性研究，國內(nèi)外均未見報道。
　　RNA干擾（RNA interfering，RNAi）技術目前已廣泛應用于基因功能、基因表達調控、基因治療以及調控細胞行為等多個領域，成為重要的研究工具。由慢病毒介導的表達載體因其表達持久、安全性好等自身優(yōu)勢，在基因治療的

4、研究中得到了廣泛的應用，并成為目前RNAi研究和轉基因的最佳工具之一。
　　基于以上研究背景，本課題研究AEG-1在腎母細胞瘤中的表達情況，及其與臨床特征的關系及對病人預后的影響;構建靶向AEG-1特異性RNA干擾慢病毒表達載體，體外轉染人高表達AEG-1的G401細胞株，沉默其AEG-1基因的表達，研究AEG-1基因被抑制后G401細胞增殖、運動、侵襲、周期、調亡、化療敏感性等方面的影響并檢測與之相關的蛋白水平，初步探討其可能的

5、分子機制，為臨床尋找腎母細胞瘤基因治療的新靶點提供借鑒。
　　方法：
　　1.AEG-1在腎母細胞瘤中的表達及其對預后的影響:選取山東省立醫(yī)院腎母細胞瘤手術切除標本42例，應用免疫組織化學方法檢測AEG-1的表達，并分析其與臨床特征的關系及對病人預后的影響。
　　2.慢病毒介導的腎母細胞瘤細胞AEG-1基因沉默:采用實時熒光定量PCR(Real time PCR)及蛋白質印跡(western blot)技術檢測人胚腎細

6、胞株CCC-HEK-1和人腎Wilms瘤細胞株G401中AEG-1的表達情況。構建針對AEG-1基因的、帶綠色熒光蛋白標記的、由U6啟動子驅動的慢病毒RNAi載體，轉染G401細胞。熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達并確定轉染效率，通過實時熒光定量PCR、western blot分別檢測細胞轉染后AEG-1mRNA和蛋白的水平變化情況，分析并確定RNA干擾的抑制效率，最終篩選出AEG-1沉默效率較高的干擾片段。
　　3.AEG-1基

7、因沉默對腎母細胞瘤細胞生物學行為的影響及分子機制研究:將篩選出的最佳沉默效果的慢病毒載體轉染G401細胞，沉默AEG-1的基因表達，通過MTT法檢測AEG-1干擾后G401細胞增殖能力的變化;通過細胞劃痕實驗檢測AEG-1沉默后G401細胞遷移能力變化，通過transwell小室侵襲實驗檢測AEG-1基因干擾后G401細胞的侵襲能力的變化，采用western blot檢測與腫瘤細胞侵襲轉移相關的基質金屬蛋白酶MMP2和MMP9蛋白表達的

8、變化;應用流式細胞技術檢測AEG-1沉默對G401細胞周期和凋亡的影響，采用western blot檢測細胞周期相關蛋白CyclinD1、CDK2、p21Cip1、p27Kip1以及細胞凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達變化;MTT法檢測AEG-1沉默后G401細胞對化療藥物阿霉素和放線菌素D的敏感性變化情況，采用western blot檢測耐藥基因MDR1蛋白表達的變化。
　　結果：
　　1.AEG-

9、1在腎母細胞瘤中的表達及其對預后的影響:在納入研究的42例腎母細胞瘤中，腫瘤組織中AEG-1高表達21例(50％)，而瘤周正常組織中檢測不到AEG-1表達。AEG-1的表達情況在不同臨床分期(P=0.019)、病理分型(P=0.048)、復發(fā)情況(P=0.015)的患兒之間有顯著性差異，而在不同性別(P=0.751)、年齡(P=0.354)的患兒之間無顯著性差異。AEG-1高表達組的5年DFS和OS均顯著低于低表達組(P=0.006和P

10、=0.007)。
　　2.慢病毒介導的腎母細胞瘤細胞AEG-1基因沉默:real time PCR和western blot檢測證實G401細胞中AEG-1mRNA和蛋白水平顯著高于CCC-HEK-1細胞。以AEG-1mRNA基因序列為靶目標進行干擾片段設計，成功構建了2對針對AEG-1基因不同位點的特異性RNA干擾序列，經(jīng)化學修飾后與pGCSIL-GFP慢病毒載體連接，通過轉化，挑選陽性克隆進行測序，鑒定干擾片斷的插入位點和堿基

11、序列與設計相符;在293T細胞中包裝慢病毒，獲得高滴度慢病毒上清;利用慢病毒將AEG-1基因的RNA干擾片段轉染G401細胞，并測定轉染效率達80％以上，real time PCR和western blot檢測證實與未轉染組相比，干擾組(AEG-1RNAi-LV1和AEG-1RNAi-LV2)的AEG-1mRNA和蛋白水平顯著降低，其中又以AEG-1RNAi-LV1的下降更明顯，說明在2個干擾靶點中，AEG-1RNAi-LV1的干擾效果

12、做好，后續(xù)實驗選用該組。
　　3.AEG-1基因對腎母細胞瘤的生長、遷移、細胞周期及耐藥性具有明顯的調節(jié)作用:細胞劃痕實驗顯示與未轉染組相比，AEG-1干擾后細胞增殖能力不斷下降，至第5天(120h)有顯著性差異(P＜0.0001);在各個時間點的劃痕區(qū)域增寬，且在觀察48h時有顯著性差異(P=0.0413)，該結果表明下調AEG-1抑制了細胞的侵襲轉移，且有顯著性差異(P=0.0238);細胞侵襲轉移能力的下降與MMP2和MMP

13、9蛋白表達水平密切相關，MMP2與MMP9的表達明顯下調，差異顯著(P=0.0395，P=0.0213);AEG-1具有調節(jié)細胞周期的能力，結果顯示S期細胞比例明顯減少，而G0/G1期細胞比例明顯增多(P＜0.001)，調節(jié)細胞周期的蛋白p21Cip1和p27Kip1表達顯著增加(P＜0.001);AEG-1的下調亦能誘導細胞的凋亡，流式細胞儀的檢測結果表明細胞調亡比例增多(P=0.0024)，而調控細胞凋亡的核心蛋白Bcl-2蛋白表達

14、水平顯著降低(P=0.024)，Bax和Caspase-3蛋白顯著增加(P＜0.001);AEG-1也能影響腫瘤細胞對化療藥物耐藥性的變化，結果表明AEG-1的低表達對阿霉素和放線菌素D的半數(shù)抑制濃度IC50均顯著降低(P＜0.001)，MDR1蛋白表達水平顯著降低(P=0.0018)。
　　結論：
　　1.AEG-1的表達情況在不同臨床分期、病理分型、復發(fā)情況的患兒之間有顯著性差異，AEG-1高表達提示預后不良。
　

15、　2.G401細胞的AEG-1mRNA和蛋白表達水平均顯著高于對照組細胞。成功構建2種慢病毒系統(tǒng)介導AEG-1RNAi載體，可穩(wěn)定表達于靶細胞G401，能下調其目的基因AEG-1的mRNA和蛋白表達，尤其以AEG-1-RNAi-LV1沉默效果更好。
　　3.沉默AEG-1基因后，G401細胞的增殖能力下降;通過降低MMP2和MMP9蛋白表達水平，使G401細胞的遷移能力和侵襲能力下降;通過增加p21Cip1和p27Kip1蛋白表達