Gsα基因干擾對心力衰竭幼鼠心肌鈣調控蛋白的作用研究.pdf

1、研究背景:正常情況下,交感神經遞質激活β-腎上腺素能受體(p-adrenoreceptor,β-AR)后,后者與Gs蛋白結合,Gs蛋白異源三聚體a、βγ解離,Gsa活化,β-AR-Gs蛋白-cAMP信號通路激活,引起L型Ca2+離子通道(L-type Ca2+channel,LTCC)、受磷蛋白(phospholamban,PLB)、蘭尼堿受體(ryanodine receptor2,RyR2)、肌鈣蛋白(cTnI)等磷酸化,并通過與其

2、附屬蛋白相互作用,如FK506結合蛋白(FK506 binding protein,FKBP12.6)、肌漿網Ca2+-ATP酶(sarcoplasmic reticulum.Ca2+ATPase,SERCA2a)等,調控鈣的攝取與釋放,誘發(fā)心肌興奮收縮耦聯(lián)?？梢?Gsa作為該信號通路上游的關鍵偶聯(lián)因子,其量和活性在維持正常心功能狀態(tài)中具有重要意義。
　　 慢性心力衰竭(haeart failure,HF)時,交感神經系統(tǒng)、腎素

3、-血管緊張素系統(tǒng)等活性增高,Gsa蛋白活性和(或)含量下降,β-AR.信號通路下調,這些改變究竟是引起心功能惡化的始動因素,還是一種適應性的保護機制,目前仍未完全明了。因心衰時其下游的鈣調控蛋白的量、活性與結構亦出現(xiàn)相應變化,鑒于鈣離子穩(wěn)態(tài)對維持心肌細胞正重慶市自然科學基金課題(編號:CSTC.2007BB5301)常功能至關重要,鈣離子的轉運調控異常,可導致心肌細胞興奮收縮耦聯(lián)功能障礙,進而影響收縮一舒張功能,并可誘發(fā)嚴重心律失常,因

4、此探索心衰時Gsa變化對鈣調控蛋白和心功能的影響具有重要理論和臨床價值。其次目前對心衰時這一信號通路的研究所用實驗動物多為成年動物,至于在幼年動物體內是否具有不同的表現(xiàn)目前仍不清楚。本實驗擬通過構建Gsa蛋白基因干擾的慢性心衰幼鼠模型,探討Gsa蛋白變化對心衰幼鼠心肌鈣調控蛋白RyR2、FKBP12.6、PLB、SERCA2a的影響,探討Gsa變化在心衰發(fā)生發(fā)展中的意義。實驗共分三部分:
　　 第一部分靶向大鼠gnas基因shR

5、NA真核表達載體的構建與鑒定
　　 目的:構建并鑒定靶向大鼠gnas基因的短發(fā)夾RNA(short hairpinRNA,shRNA)真核表達載體。
　　 方法:根據(jù)大鼠gnas基因mRNA序列設計并合成3條shRNA,退火形成雙鏈后克隆進入線性化pGenesil-1.1載體,并進行酶切鑒定和測序,鑒定構建成功后進行后續(xù)的體外和體內實驗。
　　 結果:經酶切和測序鑒定分析,構建的shRNA已成功插入載體,并且與設

6、計序列完全相符。
　　 結論:成功構建了shRNA表達質粒載體pgnas-shRNA1、pgnas-shRNA2和pgnas-shRNA3,擴增和純化獲得理想的質粒產品,為后續(xù)研究Gsa蛋白在心衰中的作用奠定了實驗基礎。
　　 第二部分RNAi選擇性下調大鼠心肌細胞Gsα蛋白的體外實驗
　　 目的:用RNA干擾技術(RNA interference,RNAi),選擇性下調大鼠心肌細胞上Gsa蛋白的表達,篩選出抑制

7、Gsa蛋白效果最明顯的shRNA表達質粒。
　　 方法:將上述三種構建成功的RNA干擾質?；驅φ召|粒,通過脂質體LipofectamineTM LTX&PLUS轉染原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞,并設空白對照組,轉染后通過半定量RT-PCR和Western-blot法檢測Gsa mRNA和蛋白的表達情況,以內參照三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)進行標化。
　　 結果:通過LipofectamineTM LTX&PLUS進行質粒轉

8、染,細胞毒性作用相對較小。shRNA1-3均使Gsot的mRNA和蛋白表達明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),且shRNA3的抑制效果最顯著,陰性對照質粒組與空白對照組Gsa表達差異無統(tǒng)計學意義。
　　 結論:利用RNAi技術成功下調了原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞中Gsa,的表達,篩選出沉默效果最明顯的shRNA3真核表達質粒,為下一步體內實驗奠定了基礎。
　　 第三部分 Gsa基因干擾對心力衰竭幼鼠心肌鈣調節(jié)蛋白的作

9、用
　　 目的:構建Gsa蛋白基因干擾的慢性心衰幼鼠模型,闡明Gsa蛋白變化對心衰幼鼠心肌鈣調控蛋白RyR2、FKBP12.6、PLB、SERCA2a的影響,探討Gsa變化在心衰發(fā)生發(fā)展中的意義。
　　 方法:健康雄性4周齡Wistar幼鼠,隨機分三組,彩色超聲心動圖測定后,(1)Gsa基因干擾心衰組(n=13),通過經腹心包腔內注射術將上述體外實驗所篩選出來的基因沉默效果較好的質粒pgnas-shRNA3混合液,注入心

10、包腔,并進一步通過腹主動脈和下腔靜脈造瘺法構建慢性心衰模型,(2)正常鼠構建的心衰模型組(n-11),心包腔注射等量無菌PBS,并進一步通過腹主動脈和下腔靜脈造瘺法構建慢性心衰模型,3)假手術組(n=9),心包腔注射等量的無菌PBS,只穿刺腹主動脈不與下腔靜脈間造瘺。8周后復查超聲心動圖,然后,麻醉取心臟標本,進行組織病理學檢查,RT-PCR、Western-blot檢測心肌鈣調控蛋白表達。
　　 結果v8周后彩色多普勒超聲心動

11、圖對三組進行相關測定,與假手術組相比,兩心衰組的多項心功能指標均有不同程度的下降,RyR2、FKBP12.6、SERCA2a表達降低,SERCA2a活性降低。Gsa基因干擾心衰組與正常鼠構建的心衰組相比,基因干擾心衰組的左室收縮末期容積(Left ventricular end-systolic volume,LVESV)下降,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),左室射血分數(shù)(Left ventricular ejection fract

12、ion,LVEF)、左室短軸縮短率(Left ventricular fraction shortening,LVFS)升高,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),左室舒張末期內徑(Left ventricular internaldimension diastole,LVIDd)、左室收縮末期內徑(Left ventricular internaldimension systole,LVIDs)、左室舒張末期容積(Left ventric

13、ularend-diastolic volume,LVEDV)略有降低,但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；心肌鈣調控蛋白RyR2、FKBP12.6表達升高,且有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),兩者比值也升高；PLB基因與蛋白表達在各組間無顯著差異(P＞0.05),Gsa基因干擾心衰組與正常鼠構建的心衰組比,SERCA2a含量、活性增高,并具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01、P＜0.05),SERCA2a與PLB比值亦升高。
　　 結論: