重組雙鏈腺相關(guān)病毒表達(dá)Exendin-4對(duì)2型糖尿病大鼠模型的治療作用.pdf

1、目的:
　　構(gòu)建表達(dá)Exendin-4重組雙鏈腺相關(guān)病毒(dsAAV)載體,包裝并檢測(cè)重組病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞效率及表達(dá)Exendin-4濃度,觀察重組dsAAV治療2型糖尿病大鼠模型效果。
　　方法:
　　重疊延伸PCR擴(kuò)增Exendin-4基因片段,應(yīng)用基因工程方法構(gòu)建加有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子4信號(hào)肽的dsAAV載體pSSHG/NT4-Exendin-4,使用表達(dá)GFP的對(duì)照AAV轉(zhuǎn)染 NIH3T3細(xì)胞觀察轉(zhuǎn)染效率,ELISA法檢

2、測(cè)重組病毒轉(zhuǎn)染 NIH3T3細(xì)胞上清Exendin-4濃度,同時(shí)與ssAAV比較;注射重組dsAAV于糖尿病大鼠模型頜下腺,分別于2、4、6及第8周檢測(cè)血糖水平、胰島素濃度,免疫組化方法檢測(cè)頜下腺Exendin-4及胰島素的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶及測(cè)序證實(shí)載體構(gòu)建成功,測(cè)定重組 dsAAV滴度為2.5×1011pfu,較ssAA滴度高(2.5×109 pfu);dsAAV/GFP轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞表達(dá)綠色熒

3、光強(qiáng);ELISA法檢測(cè)感染dsAAV的NIH3T3細(xì)胞上清中Exendin-4的濃度為181.1±8.75pmol/ml,較 ssAAV分泌濃度(133.81±8.09pmol/ml)升高(p<0.05);dsAAV/Exendin-4治療組鼠血糖控制良好,增加胰島素分泌,與對(duì)照組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。治療組大鼠頜下腺 Exendin-4及胰島素免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性。
　　結(jié)論:
　　成功構(gòu)建、包裝可表達(dá) E