饑餓誘導環(huán)境下成骨細胞自噬與凋亡作用狀況的初步研究.pdf

1、在正畸治療的過程中,牙齒受到大小合適、方向適宜的正畸力后，壓力側牙槽骨中成骨細胞會大量死亡，破骨細胞增生，導致牙槽骨吸收；張力側成骨細胞增生，牙槽骨新骨形成，這種發(fā)生在牙槽骨的骨組織改建是正畸牙齒移動的基礎。目前研究認為，壓力側牙槽骨包括成骨細胞在內的骨細胞大量死亡，是因為正畸力作用下，牙槽骨局部微環(huán)境發(fā)生了改變，這其中包括壓力側牙周膜壓縮變窄、提供營養(yǎng)和氧氣的毛細血管在正畸力作用下管腔變窄，循環(huán)受阻，血供減少，這就導致了壓力側牙槽骨組

2、織細胞處于一個低氧、營養(yǎng)缺乏的饑餓環(huán)境，那么這種環(huán)境是如何造成牙槽骨吸收、壓力側牙槽骨細胞大量死亡的呢？細胞死亡的三種方式：壞死、自噬、凋亡，在適宜的正畸力作用下，牙槽骨改建屬于牙齒的生理性改建，骨組織不會發(fā)生細胞壞死等病理性改變，自噬與凋亡都屬于細胞自身主導的程序性死亡方式，他們都分別在壓力側骨組織細胞死亡的過程中扮演了什么樣的角色？相互關系如何？本研究針對這個問題，通過建立比格犬正畸牙齒移動模型，在體研究分析了壓力側牙槽骨正畸改建過

3、程中自噬與凋亡表達水平的變化，并進一步通過細胞體外實驗觀察了成骨細胞在饑餓環(huán)境下自噬與凋亡表達水平的變化及相互關系，對壓力側骨組織細胞的消亡關系進行了初步研究。本課題研究內容包括以下兩個方面：
　　1．牙齒移動過程中牙槽骨組織細胞自噬與凋亡水平變化的動物實驗研究
　　目的：建立比格犬正畸牙齒移動模型，檢測在正畸力作用下，壓力側牙槽骨組織形態(tài)學變化和骨組織細胞中自噬與凋亡的表達情況。
　　方法：將6只成年比格犬的24顆尖

4、牙隨機分為空白對照組、正畸加力組?？瞻讓φ战M無任何處理，正畸加力組牙齒以種植釘為支抗，以150g正畸力遠中移動尖牙，建立比格犬尖牙遠中移動模型，按正畸力作用時間分為正畸加力7天組、14天組、28天組。觀察正畸力作用下牙齒移動效果，通過HE方法分析其壓力側骨組織改建情況，利用免疫組化染色及Western blot方法，分析壓力側牙槽骨組織中自噬與凋亡的作用情況。
　　結果：比格犬尖牙在正畸力作用下，①和空白對照組相比，各實驗組尖牙遠

5、中移動明顯（P<0.05），牙齒在正畸力作用下，隨作用時間的增加移動距離不斷增長（P<0.05）；②Western blot顯示與空白對照組相比，壓力側牙槽骨組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ轉化率迅速上升，7天到達頂峰（P<0.05），caspase3蛋白表達水平7天后迅速升高，28天到達頂峰（P<0.05）；③HE結果顯示與空白對照組相比，壓力側牙槽骨組織隨著正畸力作用時間的延長吸收情況不斷加重；④免疫組化染色結果顯示加力7天組和28天組

6、的LC3染色為陽性，caspase3染色在正畸加力14天組和加力28天組為陽性。
　　結論：適宜的矯治力持續(xù)作用下，壓力側牙槽骨組織骨細胞早期出現(xiàn)自噬反應增強的現(xiàn)象，此時骨吸收現(xiàn)象不明顯；隨著矯治力持續(xù)作用，自噬減弱，凋亡開始出現(xiàn)，骨吸收程度也不斷加重。這一結果提示，壓力側牙槽骨組織骨細胞早期出現(xiàn)自噬反應增強可能是一種組織保護機制，可以延遲凋亡作用的出現(xiàn)。
　　2．饑餓誘導環(huán)境下小鼠成骨細胞自噬與凋亡相互作用的實驗研究

7、>　　目的：探討?zhàn)囸I條件下自噬與凋亡在小鼠成骨細胞中的發(fā)生情況與相互關系。
　　方法：培養(yǎng)初代MC3T3-E1小鼠成骨細胞系，將其分為饑餓誘導組與3-甲基腺素（3-MA）預處理饑餓誘導組。其中，饑餓誘導組采用單純饑餓誘導法，用厄爾氏平衡鹽溶液（earle’s balanced salt solution，EBSS）培養(yǎng)1h、2h、3h、4h、5h、6h。3-MA是一種特異性自噬抑制劑，在3-MA預處理饑餓誘導組中，正常培養(yǎng)的小鼠成

8、骨細胞加入3-MA預處理1h后，再用EBSS平衡鹽溶液培養(yǎng)1h、2h、3h、4h、5h、6h。應用透射電子顯微鏡觀察饑餓誘導組小鼠成骨細胞自噬與凋亡的形態(tài)學變化，應用Western blot免疫印跡法和Annexin V-FITC/PI雙標記流式細胞術檢測小鼠成骨細胞中自噬相關蛋白LC3，凋亡相關蛋白caspase3表達水平的變化。
　　結果：①透射電鏡結果顯示單純饑餓誘導條件下，細胞在2h前以自噬為主，2h后以凋亡為主，并隨著時

9、間的延長，凋亡水平逐漸增高；②Western blot結果顯示與饑餓誘導組相比，3-MA預處理饑餓誘導組的LC3轉化水平在1h、2h、3h、4h、5h、6h都出產生了明顯的下降趨勢（P<0.05），caspase3蛋白表達水平在1h、2h、3h和4h增高（P<0.05)，但0h、5h和6h無差異（P>0.05）；③Annexin V-FITC/PI檢測結果證明和單純饑餓誘導組相比，3-MA預處理組僅在1h、2h、3h和4h促進了細胞凋亡

10、（P<0.05），而并未影響到0h、5h和6h的細胞凋亡（P＞0.05）。
　　結論：在饑餓誘導環(huán)境成骨細胞早期發(fā)生的自噬作用，可能是細胞避免死亡的一種保護機制，延遲凋亡作用出現(xiàn)的時間。
　　本研究中體內、體外兩方面的實驗結果初步說明，當正畸力作用于牙齒后，其壓力側牙槽骨組織早期出現(xiàn)的自噬作用加強現(xiàn)象可能是骨組織細胞對抗氧氣、營養(yǎng)不足的一種保護機制，可以拮抗、延緩凋亡作用的出現(xiàn)。一旦這種機體保護機制減弱、消失，骨組織細胞就會