有機(jī)鍺聯(lián)合二甲雙胍對2型糖尿病大鼠治療增敏作用的實驗研究及機(jī)制探討.pdf

1、無論是在發(fā)達(dá)國家還是發(fā)展中國家，糖尿病正以迅速發(fā)展的勢頭成為現(xiàn)代社會的流行病，嚴(yán)重危害公眾健康。據(jù)WHO統(tǒng)計，2000年糖尿病的發(fā)病率為2.8％，約有1.71億患者;到2030年預(yù)計將增長到4.4％，患病人數(shù)高達(dá)3.66億。糖尿病及其并發(fā)癥不僅影響了患者生活質(zhì)量，也對社會醫(yī)療保健帶來沉重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
　　 目前2型糖尿病(Type2 diabetes mellitus，T2DM)尚無根治方法，主要以對癥治療為主，長期藥物治療會使治

2、療效果降低。鹽酸二甲雙胍是2型糖尿病治療的基礎(chǔ)用藥，二甲雙胍的降糖作用主要是增加糖無氧酵解和抑制肝糖異生、降低肝糖輸出，近年來大量研究證實，二甲雙胍可通過增高糖尿病狀態(tài)下骨骼肌GLUT4mRNA和蛋白水平，促進(jìn)骨骼肌中GLUT4的轉(zhuǎn)位來增加周圍組織對胰島素的敏感性。
　　 近年來研究發(fā)現(xiàn)，微量元素在胰島素的生成、作用發(fā)揮以及糖尿病人的能量代謝中起著極為重要的作用，微量元素鉻、硒、鋅對骨骼肌細(xì)胞膜上的GLUT4的表達(dá)均有影響，鍺元

3、素在抗氧化應(yīng)激等方面與鉻、硒、鋅很相似，已有文獻(xiàn)報道，有機(jī)鍺(Ge-132)對糖尿病小鼠具有明顯的預(yù)防血糖升高的作用，然而，國內(nèi)尚未見其在2型糖尿病治療方面的相關(guān)實驗研究，本實驗通過觀察有機(jī)鍺(Ge-132)聯(lián)合鹽酸二甲雙胍對2型糖尿病治療的影響，初步探討其相關(guān)機(jī)制。
　　 研究目的：
　　 本實驗通過觀察聯(lián)合應(yīng)用鹽酸二甲雙胍和有機(jī)鍺(Ge-132)對2型糖尿病大鼠治療的影響，為2型糖尿病的預(yù)防和治療提供新的思路和方向。

4、
　　 方法：
　　 一、2型糖尿病大鼠模型的制備
　　 本實驗利用高糖高脂飲食誘導(dǎo)聯(lián)合小劑量STZ腹腔注射的方法制備2型糖尿病動物模型，具體方法為:
　　 （一）、動物分組及處理
　　 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，逐一稱重，隨機(jī)分成2組，實驗組40只，空白對照組10只。實驗組飼糖尿病大鼠專用飼料;對照組飼喂實驗大鼠普通飼料4周后，全部大鼠禁食不禁水12 h，測空腹血糖并稱重，然后給實驗組大鼠一性腹腔注

5、射STZ30rag/(kg.Bw)，以空腹血糖值≥7.8mol/L為標(biāo)準(zhǔn)。
　　 （二）、糖耐量實驗
　　 為驗證所制備的糖尿病大鼠模型為2型糖尿病模型，進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗:建模成功后，隨機(jī)選取實驗組及空白對照組大鼠各10只，乙醚吸入式麻醉后，眶靜脈叢取血，測其空腹血糖(0min)，留取1ml血液，3000r/min離心15min后分離血清待測空腹血清胰島素(0min)后，按2g/kg予以50％葡萄糖溶液灌胃，于糖負(fù)

6、荷后30、60、120、180 min測定即時血糖，并于每一時點取血1 ml，離心分離血清（方法同前），-20℃保存，待測血清胰島素;計算胰島素曲線下面積;穩(wěn)態(tài)模型法評估胰島素抵抗，胰島素抵抗的標(biāo)準(zhǔn):HOMA-IR與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 二、有機(jī)鍺聯(lián)合鹽酸二甲雙胍對2型糖尿病大鼠血糖水平的影響
　　 （一）實驗動物的分組
　　 將建模成功的40只SD大鼠隨機(jī)分為四組:模型對照組、二甲雙胍組、有機(jī)鍺(

7、Ge-132)組、二甲雙胍+有機(jī)鍺(Ge-132)組。動物飼養(yǎng)在清潔級動物房，5只一籠，實驗組與空白對照組同樣飼喂實驗大鼠普通飼料，自由飲食及去離子水;環(huán)境溫度為25℃±1℃，相對濕度為40％-60％;飼養(yǎng)員晝夜循環(huán)為12h/12h(8:00am-8:00pm)。
　　 （二）實驗處理
　　 1、實驗組大鼠血糖穩(wěn)定一周后，空白對照組和模型對照組:0.5％羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)5ml/kg.d灌胃;二甲雙胍組:鹽酸

8、二甲雙胍CMC-Na混懸液200mg/kg.d灌胃;有機(jī)鍺(Ge-132)組:Ge-132CMC-Na混懸液20mg/kg.d灌胃;二甲雙胍+有機(jī)鍺(Ge-132)組:鹽酸二甲雙胍CMC-Na混懸液200mg/kg.d+ Ge-132 CMC-Na混懸液20mg/kg.d灌胃。每周一、五測體重;周二、六測進(jìn)食量、飲水量;周日測空腹血糖。各組試驗干預(yù)均為8周。觀察各組空腹血糖差異。
　　 三、有機(jī)鍺(Ge-132)對2型糖尿病治療

9、具有增效作用機(jī)制的初步探討
　　 （一）實驗動物的分組
　　 實驗動物的分組同第二部分。
　　 （二）實驗處理
　　 1、實驗干預(yù)8周后，有機(jī)鍺(Ge-132)對2型糖尿病大鼠血糖水平的影響具體的檢測方法及條件同第二部分。
　　 2、免疫印跡法測量2型糖尿病大鼠骨骼肌中GLUT4蛋白水平:
　　 (1)組織勻漿
　　 干預(yù)8周后，處死各組大鼠，取適量右側(cè)大腿的比目魚肌100mg，按

10、1∶9稀釋成1％的組織勻漿待測。
　　 (2)蛋白含量的測定(BCA法蛋白濃度測定)
　　 根據(jù)樣品的數(shù)量，按BCA法蛋白濃度測定樣品中目的蛋白的含量，測定A562吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出蛋白濃度。
　　 (3) Western Blotting
　　 抽提的蛋白經(jīng)過蛋白定量后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳條件為:80V*30min，待Marker完全分開后，轉(zhuǎn)為120V。
　　 蛋白轉(zhuǎn)入PV

11、DF膜，將PVDF膜與X射線片一同放入暗合盒內(nèi)爆光，待顯色后即可照相，照片經(jīng)掃描后應(yīng)用圖像分析軟件進(jìn)行分析。
　　 3、免疫組織化學(xué)染色(SP法)測量骨骼肌中GLUT4蛋白表達(dá):
　　 (1)組織切片制備
　　 適量右側(cè)大腿的比目魚肌用4％多聚甲醛固定固定，20％蔗糖沉降過夜(4℃)，OCT包埋后用冰凍切片機(jī)恒冷箱切片，制成15μ m的骨骼肌切片。
　　 (2)免疫組化染色
　　 將切片SP顯色，

12、蘇木素復(fù)染、封片。在多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)上，測定陽性染色面積百分比來衡量GLUT4蛋白在骨骼肌組織中的表達(dá)水平。
　　 四、數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理
　　 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，血糖水平在各組間的比較利用重復(fù)測量資料的方差分析。兩組間差異采用成組設(shè)計資料的t檢驗，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗和SNK-q檢驗。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，以P＜0.05作為有統(tǒng)計學(xué)意義。直接利用Gene

13、 tools對Western-blotting結(jié)果進(jìn)行分析。分析結(jié)果采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計處理。
　　 實驗結(jié)果：
　　 一、2型糖尿病大鼠模型的制備
　　 （一）適應(yīng)性喂養(yǎng)期間大鼠一般情況
　　 大鼠精神狀態(tài)良好，糖尿病鼠專用飼料喂養(yǎng)4周后，實驗組與空白對照組相比體重(Body weight，BW)和FPG均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 （二）2型糖尿病大鼠模型建立成功

14、r>　　 建模成功后實驗組大鼠身體進(jìn)行性消瘦，反應(yīng)遲鈍，毛色枯黃，大便稀軟。建模成功后實驗組與空白對照組相比FPG升高（見圖4）、胰島素分泌高峰延遲，HOMA-IR及AUCi均明顯高于空白對照組，具有統(tǒng)計學(xué)差異，說明實驗組大鼠存在胰島素抵抗，符合2型糖尿病的發(fā)病特點。
　　 二、有機(jī)鍺聯(lián)合鹽酸二甲雙胍對2型糖尿病大鼠血糖水平的影響
　　 （一）2型糖尿病大鼠模型干預(yù)8周后，各組大鼠的FPG及GSP的變化
　　

15、2型糖尿病大鼠模型干預(yù)8周后，測其各組大鼠的FPG，結(jié)果如下:與空白對照組相比，實驗組大鼠血清中FPG、GSP均高于空白對照組;模型對照組與有機(jī)鍺(Ge-132)組無明顯差異(p＞0.05);二甲雙胍組和二甲雙胍+有機(jī)鍺(Ge-132)組FPG、GSP均低于模型對照組、有機(jī)鍺(Ge-132)組，具有統(tǒng)計學(xué)差異;二甲雙胍+有機(jī)鍺(Ge-132)組FPG、GSP低于二甲雙胍組，有統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.05)，說明有機(jī)鍺與二甲雙胍聯(lián)合治療2型糖

16、尿病大鼠的效果優(yōu)于單用二甲雙胍的治療效果，但是單用有機(jī)鍺不能降低2型糖尿病大鼠的FPG。
　　 （二）調(diào)整干預(yù)措施后，二甲雙胍組和二甲雙胍+有機(jī)鍺(Ge-132)組FPG的變化
　　 在二甲雙胍組的胃飼液中加入有機(jī)鍺(Ge-132) cmc-Na混懸液20mg/kg，同時去除二甲雙胍+有機(jī)鍺(Ge-132)中的有機(jī)鍺(Ge-132)后，分別于干預(yù)8周后的末次空腹血糖值做統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)二甲雙胍組加入有機(jī)鍺(Ge-132)后與

17、8周后的末次血糖無統(tǒng)計學(xué)差異，而與二甲雙胍+有機(jī)鍺(Ge-132)組有統(tǒng)計學(xué)差異，重復(fù)試驗結(jié)果相同。
　　 三、有機(jī)鍺(Ge-132)對2型糖尿病治療具有增敏作用機(jī)制的初步探討
　　 （一）各組大鼠骨骼肌中GLUT4蛋白表達(dá)免疫印跡法結(jié)果
　　 利用單因素方差分析，對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)與空白對照組比較，模型對照組大鼠胞膜GLUT4表達(dá)明顯下降;與模型對照組比較，二甲雙胍+有機(jī)鍺(Ge-132)組、二甲雙胍組、有

18、機(jī)鍺(Ge-132)組均增加;二甲雙胍+有機(jī)鍺(Ge-132)組較二甲雙胍組表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 （二）、各組大鼠骨骼肌中GLUT4蛋白表達(dá)免疫組化法結(jié)果
　　 免疫組化染色結(jié)果以大鼠骨骼肌胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色物質(zhì)為陽性，結(jié)果顯示:空白對照組大鼠骨骼肌的陽性面積百分比最大;模型對照組骨骼肌細(xì)胞膜上陽性面積百分比明顯減少;二甲雙胍+有機(jī)鍺(Ge-132)組陽性面積百分比接近空白對照組;而二甲雙胍組或有機(jī)鍺(Ge-

19、132)組細(xì)胞膜上陽性面積百分比僅部分增加。免疫組織化學(xué)方法所得結(jié)果與免疫印跡一致。
　　 結(jié)論：
　　 本實驗通過高糖高脂飲食誘導(dǎo)聯(lián)合小劑量腹腔注射STZ成功制備2型糖尿病動物模型，經(jīng)過觀察有機(jī)鍺(Ge-132)對2型糖尿病大鼠治療的影響以及骨骼肌中GLUT4蛋白表達(dá)免疫印跡法和免疫組化法的檢測結(jié)果，初步探討了有機(jī)鍺(Ge-132)對2型糖尿病治療具有增敏效果的機(jī)制。主要結(jié)論如下:
　　 （一）有機(jī)鍺聯(lián)合鹽酸二

20、甲雙胍對2型糖尿病大鼠血糖水平的影響
　　 1、2型糖尿病大鼠模型干預(yù)8周后，測其各組大鼠的FPG，結(jié)果有機(jī)鍺(Ge-132)與二甲雙胍聯(lián)合治療2型糖尿病大鼠的效果優(yōu)于單用二甲雙胍的治療效果，但是單用有機(jī)鍺不能降低2型糖尿病大鼠的FPG。調(diào)整干預(yù)措施后，二甲雙胍組和二甲雙胍+有機(jī)鍺(Ge-132)組FPG的變化，也說明有機(jī)鍺(Ge-132)對2型糖尿病治療具有增效作用。
　　 （二）各組大鼠骨骼肌中GLUT4蛋白表達(dá)結(jié)果

21、
　　 利用單因素方差分析，對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)與空白對照組比較，模型對照組大鼠胞膜GLUT4表達(dá)明顯下降;與模型對照組比較，二甲雙胍+有機(jī)鍺（Ge-132）組和二甲雙胍組的胞膜GLUT4表達(dá)增加;二甲雙胍+有機(jī)鍺(Ge-132)組較二甲雙胍組增加。
　　 免疫組化染色結(jié)果顯示:空白對照組大鼠骨骼肌的細(xì)胞膜上GLUT4廣泛分布;模型對照組骨骼肌細(xì)胞膜上GLUT4表達(dá)明顯減少;二甲雙胍+有機(jī)鍺(Ge-132)組GLUT4

22、的表達(dá)接近空白對照組;而二甲雙胍組或有機(jī)鍺(Ge-132)組細(xì)胞膜上GLUT4表達(dá)僅部分增加。免疫組織化學(xué)方法所得結(jié)果與免疫印跡一致。
　　 綜上所述，通過對2型糖尿病大鼠的FPG、GSP以及骨骼肌中細(xì)胞膜上GLUT4的含量的表達(dá)比較，均說明有機(jī)鍺(Ge-132)與二甲雙胍聯(lián)合治療2型糖尿病大鼠的效果優(yōu)于單用二甲雙胍的治療效果，有機(jī)鍺(Ge-132)對2型糖尿病治療具有增效作用。這種增效作用可能是有機(jī)鍺(Ge-132)通過糾正糖