白細(xì)胞介素10受體突變引起新生兒期炎癥性腸病的發(fā)病機(jī)制及基因診斷.pdf

1、研究背景：
　　炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）是指病因未明的炎癥性腸炎,包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎。其主要的臨床特征為腹痛、腹瀉、腸道出血、代謝混亂和瘺管形成。嬰兒期 IBD只占兒童 IBD的1％，在出生前3個(gè)月發(fā)病的只有0.25%。IBD病因不完全清楚，通常認(rèn)為是多基因突變和環(huán)境等多因素綜合作用導(dǎo)致腸道免疫功能混亂的結(jié)果。但是新生兒時(shí)期 IBD卻不完全支持這個(gè)理論，因?yàn)樾律鷥航佑|外部環(huán)

2、境很少，自身基因在發(fā)病中其主導(dǎo)因素。近年來(lái)全世界多個(gè)中心均研究表明早期 IBD尤其是出生后1個(gè)月發(fā)病，多為單基因突變引起，白細(xì)胞介素（IL）-10或者 IL-10受體（包括 IL-10RA和IL-10RB）突變均可以導(dǎo)致嚴(yán)重的甚至累及整個(gè)腸道的 IBD，此類患兒常規(guī)治療效果較差，早期進(jìn)行骨髓干細(xì)胞移植可降低病死率。成人發(fā)病的 IBD和嬰兒期發(fā)病的 IBD的分子學(xué)發(fā)病機(jī)制、治療方法的選擇、預(yù)后兩者均有很大的區(qū)別。目前國(guó)內(nèi)只有2篇新生兒IB

3、D的病例報(bào)道，尚無(wú)系統(tǒng)性的研究報(bào)道。本研究擬對(duì)我院新生兒期發(fā)病的 IBD患者進(jìn)行基因診斷，發(fā)病學(xué)機(jī)制的研究。提高兒科醫(yī)生對(duì)本疾病的認(rèn)識(shí)，為今后臨床早期發(fā)病 IBD的診斷治療提供新的思路。
　　目的：
　　對(duì)2例新生兒期發(fā)病的癥性腸?。↖BD）進(jìn)行白細(xì)胞介素（IL）-10受體基因診斷，并探討其發(fā)病機(jī)制，建立早期 IBD實(shí)驗(yàn)室診斷流程。
　　方法：
　　研究對(duì)象為廣州市婦女兒童醫(yī)療中心2010至2014年新生兒科和消

4、化科住院的2例疑診新生兒期 IBD同胞兄弟。先證者男，26 d，3.73 kg，出生后第9天出現(xiàn)反復(fù)發(fā)熱，大便次數(shù)增多于2014年入院。先證者兄，8個(gè)月大死亡，6個(gè)月大時(shí)因反復(fù)黏液膿血便5個(gè)月余，發(fā)熱5 d于2010年入院。采用PCR方法擴(kuò)增先證者及其家族成員 IL-10受體基因組 DNA，本院兒童保健科健康體檢兒童的資料作為對(duì)照組。采用反轉(zhuǎn)錄 PCR擴(kuò)增先證者 IL-10受體α亞單位(IL-10RA)，PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向序列測(cè)定，We

5、stern分析先證者 IL-10RA蛋白以及 IL-10刺激后磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（P-STAT3）蛋白的表達(dá)。構(gòu)建野生型和突變型的 pEGFP-C1-IL-10RA以及野生型的 pERFP-C1-IL-10RB質(zhì)粒，用野生型pEGFP-C1-IL-10RA轉(zhuǎn)染患兒?jiǎn)魏肆馨图?xì)胞（PBMC），以及 pEGFP-C1-IL-10RA和pERFP-C1-IL-10RB體外共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后均用IL-10刺激培養(yǎng)，Weste

6、rn blot檢測(cè)其下游 P-STAT3蛋白的表達(dá)。脂多糖+IL-10刺激培養(yǎng)外周血PBMC收集上清，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)腫瘤壞死因子(TNF)-α水平。
　　結(jié)果
　　測(cè)序結(jié)果：先證者及其兄均為 IBD患者，基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn) IL-10RA突變位點(diǎn)均為c.537G>A為同義突變，突變位點(diǎn)位于外顯子4和內(nèi)含子4連接處即CG/GT突變?yōu)?CA/GT,先證者 RT-PCR產(chǎn)物 T-A克隆測(cè)序發(fā)現(xiàn)（c.519-537d

7、el GGTGCCGGGAAACTTCAC p.LYS173ASNfs*7)，證實(shí)為剪接突變。另外一條DNA鏈基變位點(diǎn)為(c.668G>C，p.C223S)，患兒母親攜帶的基因突變位點(diǎn)為c.537G.>A、父親為 c.668G>C p.（C223S），均為突變基因的攜帶者，先證者及其兄均均為復(fù)合雜合隱性遺傳突變引起。
　　Western blot結(jié)果：先證者和正常者均可表達(dá) IL-10RA，但是 IL-10RA下游功能明顯缺陷，I

8、L-10刺激后下游 P-STAT3（Tyr-705）蛋白無(wú)表達(dá)。正常者和先證者單核淋巴細(xì)胞在 IL-6刺激后均可以表達(dá) P-STAT3（Tyr-705）蛋白。野生型的 pEGFP-C1-IL-10RA和pERFP-C1-IL-10RB質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞經(jīng) IL-10細(xì)胞因子刺激后可表達(dá) P-STAT3（Tyr-705）蛋白，患兒突變的 pEGFP-C1-IL-10RA與野生型的 pERFP-C1-IL-10RB質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT

9、細(xì)胞經(jīng) IL-10刺激后幾乎不表達(dá) P-STAT3（Tyr-705）蛋白。野生型 pEGFP-C1-IL-10RA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染患兒?jiǎn)魏肆馨图?xì)胞后 IL-10刺激可高表達(dá) P-STAT3（Tyr-705）蛋白。
　　TNF-α濃度檢測(cè)：先證者與對(duì)照者未處理組 TNF-α的濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義【（108±40）比（69±15）ng/L，t=1.704,P=0.164】；先證者脂多糖處理組 TNF-α的濃度平均值與對(duì)照者脂多糖處理組差異也無(wú)

10、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義【（2305±280）比（1854±305）ng/L，t=1.889,P=0.132】；先證者脂多糖+IL-10共刺激培養(yǎng) TNF-α的平均值明顯高于對(duì)照者【（2100±356）比（200±50）ng/L，t=9.154,P=0.001)】。
　　結(jié)論：
　　（1）IL-10受體突變能夠引起嬰兒早期炎癥性腸病，包括新生兒潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病，為常染色體隱性遺傳疾病。此型對(duì)激素、免疫抑制劑治療效果較差。骨髓移植治療

11、能夠達(dá)到長(zhǎng)期持續(xù)緩解。
　?。?）IL-10RA基因組 c.537G>A和c.668G>C p.（C223S）均為新發(fā)現(xiàn)致病突變位點(diǎn)。其中c.537G>A為剪切突變。 T-A克隆測(cè)序發(fā)現(xiàn) c.519-537del GGTGCCGGGAAACTTCAC p.LYS173ASNfs*7。
　?。?） IL-10 RA突變后 PBMC幾乎不表達(dá) P-STAT3蛋白，患者 PBMC負(fù)反饋調(diào)節(jié)功能受損，LPS刺激后 TNF-α分泌增加