胃癌多藥耐藥相關蛋白糖基化及磷酸化研究.pdf

1、【背景】
　　胃癌是我國死亡人數(shù)最多的惡性腫瘤之一，傳統(tǒng)化療是其最主要的治療方式。但在臨床應用中，患者往往出現(xiàn)多藥耐藥現(xiàn)象（MDR），導致化療失敗而最終死亡。雖然針對胃癌多藥耐藥已有大量報道，但其根本機制仍未闡明，說明其產(chǎn)生機制的復雜性，也提示我們應從新的角度進行研究。既往研究認為，是蛋白表達水平的改變，引起了化療藥物與靶標的作用變化，從而導致耐藥表型產(chǎn)生。然而，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質翻譯后修飾可能也起了重要的作用。
　

2、　糖基化和磷酸化是最重要的蛋白質翻譯后修飾之一，與腫瘤發(fā)生發(fā)展及耐藥等惡性表型密切相關，是近年來的研究熱點。大量研究證明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與蛋白質糖基化修飾改變關系密切。一方面，糖基化可以改變蛋白質正常的功能、活性及蛋白間相互作用，從而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及各種惡性生物學行為中發(fā)揮著調節(jié)功能；另一方面，不同類型和階段的腫瘤所表達的蛋白質糖鏈組分具有特異性，使其具有成為腫瘤標志物的潛能。而在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，細胞內磷酸化也發(fā)生了重要改變，并發(fā)

3、揮了關鍵的調節(jié)作用，具體發(fā)生改變的磷酸化蛋白則可作為腫瘤診斷的標志物，甚至是治療的靶標。
　　但是,目前尚沒有相關研究來從整體上探討糖基化和磷酸化改變與胃癌多藥耐藥的關系，臨床上也沒有可用于預測耐藥，指導個體化用藥的有效標志物。本研究則通過多種蛋白組學方法從整體上對這一問題進行探討。
　　【目的】
　　1、研究胃癌多藥耐藥過程中，蛋白整體糖基化水平的改變，篩選差異蛋白作為候選標志物；2、探討胃癌多藥耐藥產(chǎn)生過程中，磷酸

4、化蛋白及相應信號通路的改變；3、研究蛋白糖基化改變參與調解胃癌多藥耐藥的機制。
　　【方法】
　　1、利用MTT藥敏實驗驗證胃癌多藥耐藥細胞系的耐藥指數(shù)；2、運用糖蛋白質譜技術檢測鑒定細胞模型中總糖蛋白，分析整體糖基化水平；3、通過細胞表面糖蛋白捕獲策略檢測鑒定細胞模型中膜糖蛋白變化情況，篩選差異表達糖蛋白；4、通過基因重組方法構建多藥耐藥蛋白1（MDR-1）的正義表達載體和定點突變載體；5、運用MTT藥敏實驗和多藥耐藥相關

5、分子生物學檢測技術，研究糖基化對MDR-1調節(jié)耐藥功能的影響及機制；6、運用磷酸蛋白質譜技術檢測鑒定細胞模型中總磷酸化蛋白表達差異變化情況，篩選差異表達磷酸化蛋白；7、通過生物信息學分析差異磷酸化蛋白參與的信號通路。
　　【結果】
　　1、SGC7901/VCR和SGC7901/ADR是良好的胃癌多藥耐藥研究細胞模型。
　　我們首先用MTT藥敏實驗檢測了兩株胃癌耐藥細胞系與親本細胞分別對其誘導化療藥物的藥物敏感性。結果

6、發(fā)現(xiàn)SGC7901細胞對VCR的IC50值為0.57±0.13μg/ml，對ADR的IC50值為0.14±0.06μg/ml，而SGC7901/VCR細胞對VCR藥物的IC50值為31.23±0.62μg/ml，SGC7901/ADR細胞對ADR藥物的IC50值為1.62±0.29μg/ml。與親本細胞SGC7901相比，兩株耐藥細胞的耐藥指數(shù)分別上升了55倍和11倍。
　　隨后，我們又檢測了兩株耐藥細胞系對不同種類化療藥物的藥物

7、敏感性。結果顯示，兩株耐藥細胞系除了對各自誘導藥物耐受外，還對CDDP和5-Fu等多種藥物耐受，其耐藥指數(shù)明顯上升。因此，我們認為SGC7901/VCR和SGC7901/ADR細胞系是研究胃癌多藥耐藥的良好細胞模型。
　　2、胃癌耐藥細胞中蛋白整體糖基化上升。
　　通過糖蛋白質譜技術,我們在胃癌耐藥細胞系和親本細胞系中共檢測鑒定到67個糖蛋白,并得到這些蛋白的糖基化信息及蛋白相對表達水平數(shù)據(jù)。通過對比分析，大部分糖蛋白在胃癌

8、耐藥細胞系中糖基化水平上升，說明胃癌細胞在耐藥性產(chǎn)生的過程中，蛋白整體糖基化水平上升；同時我們還發(fā)現(xiàn)相應的糖基化調控酶類表達水平發(fā)生變化，即糖基轉移酶UGT1表達水平明顯上調，而甘露糖苷Laman表達則明顯下調。提示在胃癌化療中，藥物誘導糖基轉移酶UGT1表達上調和糖苷酶Laman表達下調，二者共同上調耐藥細胞蛋白整體糖基化水平。糖基化通過改變蛋白質功能，參與了多種細胞內信號通路和生理病理過程的調節(jié)，使胃癌細胞能夠逃避化療藥物的殺傷得以

9、存活，最終導致了多藥耐藥表型的產(chǎn)生。
　　3、篩選得到11個差異蛋白作為可能的胃癌多藥耐藥標志物。
　　通過細胞表面糖蛋白捕獲策略，我們最終檢測鑒定到67個糖蛋白，其中有56個(83.6％)為細胞表面膜蛋白，說明本研究策略具有良好的膜蛋白捕獲效率。隨后GeneOntology分析顯示56個糖蛋白參與了細胞凋亡、周期、轉運等多種細胞生理病理活動，而這些活動在胃癌細胞產(chǎn)生多藥耐藥性的過程中均發(fā)揮了重要的作用，提示該結果用于胃癌多

10、藥耐藥研究具有很好的可靠的參考價值。同時，以變化超過2倍為界值，我們共篩選得到11個在耐藥細胞系中表達明顯變化的糖蛋白，其中8個表達降低，3個表達升高。由于這11個蛋白在兩株多藥耐藥細胞系中具有一致的變化趨勢，因此與胃癌多藥耐藥惡性表型的相關性更好，具有良好的成為預測胃癌多藥耐藥標志物的可能性。
　　4、通過WesternBlot驗證差異糖蛋白表達，結果與質譜結果一致。
　　在11個差異蛋白中，我們選取了多藥耐藥蛋白1（P-

11、gp）和表皮生長因子受體（EGFR）進行Westernblot驗證。結果顯示，在胃癌細胞SGC7901種，P-gp表達水平較低，主要以非糖基化形式存在（分子量約為130KDa），而在兩株耐藥細胞系SGC7901/VCR和SGC7901/ADR中，P-gp則主要以糖基化形式存在（分子量約為170KDa），且表達水平顯著增高，提示P-gp可能以糖基化形式參與胃癌多藥耐藥過程的調節(jié)；而EGFR的Westernblot結果顯示，無論是耐藥細胞還

12、是親本細胞系中，EGFR的分子量均為170KDa，亦即以糖基化修飾后形式存在，但在耐藥細胞系中其表達水平顯著低于親本細胞，提示胃癌細胞產(chǎn)生耐藥性過程中，EGFR相應的信號通路可能受到抑制。這兩個蛋白的Westernblot結果與質譜得到的結果相一致，進一步證明了質譜分析方法及所得結果的可靠性。
　　5、糖基化明顯上調P-gp促胃癌細胞產(chǎn)生耐藥性的能力。
　　我們構建了P-gp的正義表達載體和定點突變載體，通過測序和轉染細胞后

13、WesternBlot驗證載體構建成功；將不同載體及對照載體轉染胃癌細胞SGC7901后進行體外MTT藥敏實驗，我們發(fā)現(xiàn)突變的P-gp蛋白可以增強胃癌細胞對VCR藥物的耐受能力，對其它藥物無明顯影響，但是野生型的P-gp蛋白則可以更加顯著的增強胃癌細胞對多種化療藥物的耐受性。這可能是由于突變的P-gp蛋白序列改變，無法經(jīng)糖基化修飾，導致雖然非糖基化形式P-gp（分子量約為140KDa）表達同樣升高，但其促進胃癌耐藥的能力較弱，而只有經(jīng)糖

14、基化修飾的野生型的P-gp蛋白（分子量約為170KDa）才具有成熟的藥物泵功能，促進胃癌對多種化療藥物產(chǎn)生耐藥性，說明糖基化修飾在P-gp促進胃癌細胞多藥耐藥表型產(chǎn)生的過程中發(fā)揮著重要的作用。
　　6、多藥耐藥相關磷酸化蛋白篩選及生物信息學分析。
　　通過磷酸化蛋白組學研究策略，我們在胃癌耐藥細胞和親本細胞系中共檢測鑒定到414個磷酸化蛋白，同時，以變化超過2倍為界值，我們共篩選得到93個在耐藥細胞系中表達明顯變化的糖蛋白，

15、其中有55個蛋白在兩株耐藥細胞系中表達同時升高，而有30個蛋白的表達均降低，其余8個蛋白僅在SGC7901/VCR或SGC7901/ADR中表達升高，提示這8個蛋白可能是不同化療藥物處理的結果，而85個在耐藥細胞系中變化趨勢一致的蛋白則可以更好的反映胃癌產(chǎn)生多藥耐藥過程中蛋白磷酸化及信號通路的改變。生物信息學分析顯示，93個差異蛋白參與了NF-κB、PI3K/Akt、TGFβ、TNF等信號通路的調控，主要調節(jié)胃腸道腫瘤的各種生理病理過程