高糖對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞sFlT-1、LOX-1表達(dá)的影響以及茶多酚的干預(yù)作用.pdf

1、目的:
　　 目前糖尿病的主要慢性并發(fā)癥涉及心臟、視網(wǎng)膜、腎臟、足及神經(jīng)都和血管損傷有關(guān)。糖尿病血管病變的發(fā)病機(jī)制主要有蛋白激酶(proteinkinasePKC)的激活，糖基化終末產(chǎn)物的堆積，多元醇代謝通路異常，氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)，炎癥反應(yīng)，多種細(xì)胞因子參與等等。氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)是目前比較公認(rèn)的發(fā)病機(jī)制之一，而且趨向認(rèn)為氧化應(yīng)激很可能是上述機(jī)制的始動(dòng)因素。高糖刺激下氧自由基清除能力下降，導(dǎo)致氧化產(chǎn)物堆積，氧化應(yīng)激可能引起PKC激活，糖基

2、化產(chǎn)物增加，多元醇通路等多條代謝途徑異常。血管病變的發(fā)生涉及多因素關(guān)聯(lián)作用的結(jié)果，但血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷則是關(guān)鍵靶細(xì)胞。糖尿病患者的血管在缺氧和高糖狀態(tài)下均可促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)的產(chǎn)生，從而引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生及新生血管形成。因此，VEGF在糖尿病血管病變的發(fā)病過(guò)程中具有十分重要的作用。可溶性血管內(nèi)皮生成因子受體1（solublefms-liketyrosinek

3、inase-1，sFlt-1）是臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的一種VEGF的相應(yīng)的結(jié)合受體，它通過(guò)與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合VEGF，阻斷其生物學(xué)活性，可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生和新生血管的形成。蔡海瑞等人的研究證實(shí)，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilicalveinendothelialcell，HUVEC)也可表達(dá)sFlt-1，但目前關(guān)于sFlt-1的研究主要集中在糖尿病視網(wǎng)膜病變，sFlt-1在糖尿病周圍血管病變中是否也存在相似的

4、作用目前研究極少。另外內(nèi)皮細(xì)胞損傷也可使血漿的低密度脂蛋白透過(guò)損傷的內(nèi)皮細(xì)胞集聚在內(nèi)皮下間隙并被氧化，引起內(nèi)皮細(xì)胞活化，氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，泡沫細(xì)胞形成從而引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化，Sawamura等在1997年發(fā)現(xiàn)新型內(nèi)皮細(xì)胞ox-LDL特異受體，即血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體1(Lectin-likeoxidizedlow-densitylipoproteinreceptor-1(LOX-1)，介導(dǎo)ox-LD

5、L的生物學(xué)活性，在AS中發(fā)揮重要作用，從而引發(fā)血管病變，但在高糖環(huán)境下是否可引起內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)LOX-1增多，目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少。茶多酚作為一種廣泛的抗氧化劑，對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞也不例外。陳露露等人的研究已證實(shí)茶多酚能有效抑制高糖所致內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷。分裂原激活的蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinases，MAPK)家族是非常保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中一組主要的信號(hào)分子，在發(fā)育和疾病發(fā)生過(guò)程中

6、起重要作用。該家族有4個(gè)成員，即細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellularregulatedproteinkinase1/2，ERK1/2)，c-junN端激酶(c-junN-terminalkinase，JNK)/應(yīng)急激活的蛋白激酶(streactivatedproteinkinase，SAPK)，p38MAPK，ERK5/BMK1(bigmitogen-activatedproteinkinase，BMK1)。p38蛋白激酶是由

7、Han等用內(nèi)毒素刺激哺乳動(dòng)物細(xì)胞，從中分離純化的酪氨酸磷酸蛋白激酶。p38是MAPK家族控制炎癥反應(yīng)最重要的成員，它可因生理性應(yīng)激、脂多糖、滲透性應(yīng)激和紫外線照射而激活。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)不同濃度的茶多酚及p38MAPK抑制劑SB203580作用于高糖體外培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞48小時(shí)，觀察sFlt-1、LOX-1的表達(dá)活性，探討高糖引起sFlt-1、LOX-1表達(dá)變化的機(jī)制以及茶多酚的保護(hù)作用，以及上述指標(biāo)是否通過(guò)p38MAPK信號(hào)通路表達(dá)，有可

8、能為糖尿病血管病變的預(yù)防和治療找到新的途徑。
　　 方法:
　　 提取新生兒臍帶，經(jīng)過(guò)胰酶消化后獲取臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，原代培養(yǎng)，達(dá)80％以上融合時(shí)予以傳代培養(yǎng)，采用3-5代細(xì)胞用于下一步實(shí)驗(yàn)。選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期細(xì)胞入組。實(shí)驗(yàn)分為15組:正常對(duì)照組（glucose5.5mmol/L，DMEM培養(yǎng)液），高糖組(glucose30mmol/L，DMEM培養(yǎng)液)，茶多酚（TP）干預(yù)組:濃度分別為10mg/L、20mg/L、3

9、0mg/L，p38MAPK抑制劑組SB203580濃度分別為10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L，分別加入正常對(duì)照組及高糖組，高滲組(甘露醇濃度24.5mmol/L+葡萄糖濃度5.5mmol/L)，除高滲對(duì)照組外，各藥物組均在高糖處理前30分鐘分別加入藥物，每組4孔細(xì)胞，加入藥物后繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，觀察HUVEC細(xì)胞的形態(tài)，MTT法檢測(cè)生存活力，RT-PCR及Elisa法分別檢測(cè)sFlt-1及LOX-1mRNA表達(dá)水平

10、及sFlt-1蛋白表達(dá)量。
　　 結(jié)果:
　　 1、同正常對(duì)照組相比，甘露醇組細(xì)胞活性雖然有所降低，但是沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);正常+茶多酚組同正常對(duì)照組相比，10mg/L濃度組細(xì)胞活性降低，30mg/L濃度組細(xì)胞活性明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05），20mg/L濃度組細(xì)胞活性同正常對(duì)照組無(wú)明顯差異(P＞0.05);高糖組的細(xì)胞活性則明顯受到抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);以不同濃度的茶多酚進(jìn)

11、行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)各個(gè)濃度組較高糖組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。(Table1)與單純高糖組比，HG+10mg/LTP組細(xì)胞活力下降(P＜0.05)，HG+20mg/LTP組細(xì)胞活力活力升高但仍低于正常對(duì)照組(P＜0.05)，HG+30mg/LTP組細(xì)胞活力較單純高糖組明顯升高(P＜0.05)，但較正常對(duì)照組仍偏低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。故TP的濃度選擇20mg/L（此濃度對(duì)正常糖中的細(xì)胞活力無(wú)影響且能夠降低高糖環(huán)境對(duì)細(xì)胞活力影響）為最適

12、實(shí)驗(yàn)劑量，作為以下實(shí)驗(yàn)的作用濃度。NG+p38MAPK抑制劑(10μmol/L，15μmol/L，20μmol/L)組HUVECs活力均較正常對(duì)照組有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，且三組中以NG+15p38抑制劑組的細(xì)胞活力最強(qiáng)，HG+p38抑制劑組(10μmol/L，15μmol/L，20μmol/L)組HUVECs活力均較單純高糖組升高但仍低于正常對(duì)照組(P＜0.05)，且三組之間細(xì)胞活力無(wú)差異，故p38MAPK抑制劑

13、的濃度選擇15μmol/L為最佳劑量，以作為以下實(shí)驗(yàn)的作用濃度。
　　 2、與正常對(duì)照組相比，高滲組的sFlt-1mRNA及蛋白含量雖有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);高糖組的sFlt-1mRNA及蛋白表達(dá)明顯減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。加入茶多酚干預(yù)后，高糖組及正常對(duì)照組的表達(dá)量均增加，且分別與干預(yù)前相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　 3、與正常對(duì)照組相比，高糖組的LOX-1mRNA表達(dá)

14、量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。加入茶多酚干預(yù)后，LOX-1mRNA表達(dá)均下降，但正常對(duì)照組加茶多酚與干預(yù)前差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高糖組加入茶多酚后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4、與正常對(duì)照組相比，高糖組p38MAPK蛋白濃度增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，加入茶多酚后，其表達(dá)量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分別與正常對(duì)照組及高糖組相比較，加入p38MAPK抑制劑SB203580后，sFlt-1mRNA、蛋白及LOX-1

15、mRNA幾乎無(wú)表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1、高糖環(huán)境可以引起臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞sFlt-1的表達(dá)活性降低，LOX-1含量增加，兩者可能在糖尿病血管病變的進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。
　　 2、茶多酚可以明顯降低高糖誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞LOX-1的高表達(dá)并上調(diào)sFlt-1的表達(dá)，減輕高糖對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用，減少動(dòng)脈硬化的發(fā)生及新生血管的形成。
　　 3、p38MAPK在高糖環(huán)境下可被激活，其抑制劑可明顯抑制L