鴨肝炎病毒分離株的鑒定及弱毒株的選育.pdf

1、鴨病毒性肝炎是由鴨肝炎病毒引起的一種急性接觸傳染性疾病，以急性發(fā)病、病程短和高死亡率為特征。該病在我國(guó)多個(gè)地區(qū)已多次爆發(fā)，且發(fā)病嚴(yán)重，流行區(qū)域廣，損失巨大，嚴(yán)重威脅著我國(guó)的養(yǎng)鴨業(yè)。鴨肝炎可由三種不同類(lèi)型的病毒引起，稱(chēng)為Ⅰ型，Ⅱ型和Ⅲ型鴨肝炎病毒。我國(guó)流行的主要是Ⅰ型鴨肝炎。但近幾年來(lái)，不斷有使用Ⅰ型鴨肝炎弱毒疫苗或高免卵黃抗體進(jìn)行預(yù)防或治療無(wú)效的鴨群爆發(fā)疑似鴨肝炎，懷疑為Ⅰ型鴨肝炎變異株或新型鴨肝炎。 本試驗(yàn)通過(guò)番鴨胚尿囊腔接種

2、，對(duì)我省采集的2份死于疑似鴨病毒性肝炎的病鴨肝組織進(jìn)行病原分離，獲得2個(gè)病毒分離株VFY株和NFY株。分離株病毒經(jīng)反復(fù)凍融，氯仿抽提，超速離心后，電鏡負(fù)染均可見(jiàn)直徑約20～40nm的病毒粒子。對(duì)VFY株病毒的理化特性研究表明：VFY株病毒對(duì)氯仿，胰酶有抵抗力，可耐受PH3.0的酸性環(huán)境。將2株分離株經(jīng)鴨胚傳至第5代，收集鴨胚尿囊液毒測(cè)定這些毒株的ELD50分別為10<'-6.52>/0.2ml，10<'-553>/0.2ml。用鴨肝炎Ⅰ

3、型弱毒苗及其血清和2株分離株進(jìn)行交叉中和試驗(yàn)，待檢毒株VFY，NFY株和DHVI型的相關(guān)系數(shù)分別為35.73％和0，而NFY株與VFY株的相關(guān)系數(shù)為83.8％。結(jié)果表明：VFY株為Ⅰ型DHV變異株，NFY株為新型DHV，VFY株與NFY株為同一血清型。這兩分離株對(duì)12～14日齡鴨胚的致死率為100％，人工感染1日齡雛番鴨(腿部肌肉注射)的致死率分別為60％和55.6％。死亡鴨呈角弓反張姿勢(shì)，剖檢主要可見(jiàn)肝臟腫大，有出血點(diǎn)或出血斑。

4、 以Ⅰ型DHv變異株實(shí)驗(yàn)感染雛番鴨，對(duì)感染雛鴨的組織病理變化進(jìn)行了觀察，結(jié)果表明：感染雛番鴨肝、腎、脾、胰、腦的組織病理變化分別表現(xiàn)為出血性、壞死性肝炎，腎小管變性及異嗜性白細(xì)胞浸潤(rùn)，壞死性脾炎，胰臟的局灶性壞死及異嗜性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和神經(jīng)細(xì)胞的變性壞死。 建立了間接ELISA法以檢測(cè)鴨肝炎病毒抗體滴度。病毒抗原經(jīng)反復(fù)凍融離心后氯仿處理，再經(jīng)Sephadex G-200分子篩層析提純獲得包被抗原，制備了陽(yáng)性血清(中和效價(jià)1:99)

5、，陰性血清，酶標(biāo)二抗。抗原包被量10ug/ml，酶標(biāo)二抗稀釋800倍，血清稀釋25倍，臨界值為0.342，結(jié)果以能產(chǎn)生陽(yáng)性反應(yīng)的血清最高稀釋度為該血清的終點(diǎn)抗體滴度。 對(duì)Ⅰ型DHv變異株進(jìn)行致弱選育研究。將Ⅰ型DHV變異株(VFY株)在sPF雞胚上連續(xù)傳70代(VFY-70)致弱后，經(jīng)毒力返強(qiáng)試驗(yàn)表明VFY-70在1日齡雛番鴨體內(nèi)連續(xù)傳5代不出現(xiàn)毒力返強(qiáng)現(xiàn)象，是安全的。VFY-70稀釋成100倍，200倍，500倍后分別免疫1日

6、齡雛番鴨，對(duì)免疫的雛番鴨采血，間接ELISA法測(cè)定血清的效價(jià)，免疫雛鴨在第5天時(shí)抗體水平達(dá)到高峰，然后呈逐漸下降趨勢(shì)。同時(shí)在免疫組雛番鴨5日齡時(shí)用Ⅰ型DHV變異株強(qiáng)毒攻毒，觀察雛鴨的死亡情況。由結(jié)果可知，VFY70株在100倍稀釋時(shí)，保護(hù)率達(dá)100％，而500倍稀釋時(shí)，保護(hù)率只為70％。結(jié)果表明，VFY70株經(jīng)過(guò)雞胚傳代致弱后在毒力下降的同時(shí)免疫原性不受影響，可以作為疫苗的候選株。本研究從病原學(xué)工作入手分析鴨肝炎病毒的致病性，在病原學(xué)工