低劑量X線(xiàn)照射對(duì)成骨細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞骨架的研究.pdf

1、X射線(xiàn)屬于電離輻射的一種,在醫(yī)學(xué)中有著廣泛的應(yīng)用,骨科疾病患者常常需要接受多次X射線(xiàn)的照射,而輻照的劑量屬低劑量范圍以?xún)?nèi)。低劑量X線(xiàn)輻照離體成骨母細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化過(guò)程,從而加速骨折愈合,但其具體機(jī)制尚不清楚。我們的前期研究使用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)低劑量X線(xiàn)照射會(huì)促進(jìn)與細(xì)胞骨架相關(guān)基因的表達(dá),可能通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)-局部粘附-細(xì)胞骨架途徑參與低劑量X線(xiàn)照射促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化過(guò)程。
　　目前,有關(guān)低劑量X線(xiàn)照射對(duì)成骨細(xì)

2、胞骨架的研究還比較少。低劑量X線(xiàn)照射成骨細(xì)胞后,肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的變化情況及機(jī)制尚不明了。本研究采用醫(yī)用直線(xiàn)加速器對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行0Gy(對(duì)照組)、0.5Gy(低劑量組)、5Gy(高劑量組) X線(xiàn)照射,觀(guān)察成骨細(xì)胞在X線(xiàn)照射后細(xì)胞內(nèi)微結(jié)構(gòu)及纖維肌動(dòng)蛋白的變化,通過(guò)Real-Time PCR及Westtern blot技術(shù)檢測(cè)胞內(nèi)RhoA/ROCK、cofilin及其磷酸化水平變化,探討低劑量X線(xiàn)照射參與成骨前體細(xì)胞骨架重構(gòu)的機(jī)制,以及細(xì)胞

3、骨架重構(gòu)對(duì)成骨細(xì)胞增殖分化的影響,為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)低劑量電離輻射的生物學(xué)效應(yīng)提供理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)分為三部分:
　　實(shí)驗(yàn)一:不同劑量X線(xiàn)照射對(duì)成骨細(xì)胞形態(tài)及肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重構(gòu)的影響
　　目的:觀(guān)察不同劑量X線(xiàn)照射作用于成骨細(xì)胞后,細(xì)胞形態(tài)、胞內(nèi)微結(jié)構(gòu)及纖維肌動(dòng)蛋白的變化情況,為進(jìn)一步研究低劑量X線(xiàn)照射引起成骨細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架重構(gòu)的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:從中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)購(gòu)得MC3T3-E1細(xì)胞,采用醫(yī)用直線(xiàn)加速器以

4、0Gy、0.5Gy、5Gy(劑量率為200 cGy/min)作用成骨細(xì)胞后,用倒置相差顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)的變化,透射電鏡觀(guān)察細(xì)胞內(nèi)微結(jié)構(gòu)變化以及FITC-phalloid in對(duì)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的F-actin進(jìn)行染色,熒光顯微鏡下觀(guān)察各實(shí)驗(yàn)組肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的變化。
　　結(jié)果:0.5Gy、5Gy組細(xì)胞的F-actin在照射后2h后遭到破壞,且隨著輻射劑量的增加破壞程度越嚴(yán)重,呈劑量依賴(lài)性。但24h后細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架發(fā)生重構(gòu),F-ac

5、tin染色逐漸增強(qiáng)、纖維增粗,照射后第3天時(shí)最為顯著,但至第5天時(shí)F-actin染色逐漸恢復(fù)正常,與0Gy組接近。
　　結(jié)論:X線(xiàn)輻射短時(shí)間內(nèi)能使成骨前體細(xì)胞骨架破壞、F-actin解聚,但隨后細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架發(fā)生重構(gòu),F-actin表達(dá)增強(qiáng),至第5d時(shí)逐漸恢復(fù)正常。
　　實(shí)驗(yàn)二:RhoA/ROCK信號(hào)通路在介導(dǎo)低劑量X線(xiàn)照射引起成骨細(xì)胞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重構(gòu)中的研究
　　目的:研究RhoA/ROCK信號(hào)通路在低劑量X線(xiàn)

6、照射引起肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重構(gòu)中的作用。
　　方法:采用醫(yī)用直線(xiàn)加速器以0Gy、0.5Gy、5Gy作用成骨細(xì)胞后,以Real-Time PCR及Westtern blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)RhoA、ROCK、cofilin及磷酸化 cofilin(phospho-cofilin)水平變化。隨后以ROCK激酶特異性抑制劑Y27632預(yù)處理成骨細(xì)胞,觀(guān)察X線(xiàn)照射后細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架變化情況。
　　結(jié)果:成骨細(xì)胞經(jīng)0.5、5Gy X線(xiàn)照射

7、后1天,各實(shí)驗(yàn)組RhoA、ROCK、phospho-cofilin含量開(kāi)始升高,第3天變化最為明顯,直至5天后各實(shí)驗(yàn)組RhoA、ROCK、phospho-cofilin含量趨于下降。Y27632預(yù)處理組細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架遭到破壞,肌動(dòng)蛋白纖維排列稀疏紊亂,阻斷了低劑量X線(xiàn)照射引起的細(xì)胞骨架重構(gòu)。
　　結(jié)論:低劑量X線(xiàn)照射可以通過(guò)RhoA/ROCK信號(hào)通路引起成骨細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架重構(gòu)。
　　實(shí)驗(yàn)三:抑制細(xì)胞骨架重構(gòu)對(duì)低劑量X線(xiàn)作

8、用下成骨細(xì)胞增殖分化的影響
　　目的:研究RhoA/ROCK信號(hào)通路在低劑量X線(xiàn)照射促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化過(guò)程中的作用。
　　方法:在對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行低劑量X線(xiàn)照射前,使用ROCK激酶特異性抑制劑Y-27632預(yù)處理細(xì)胞,隨后以CCK-8、ALP活性檢測(cè)、茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色、Western blot技術(shù)檢測(cè)經(jīng)0.5Gy X線(xiàn)照射后成骨細(xì)胞的增殖、分化情況。
　　結(jié)果:使用ROCK激酶抑制劑Y27632處理細(xì)胞后可以阻斷低劑量