軸突導向分子EphA5誘導中腦神經(jīng)上皮干細胞向紋狀體投射的實驗研究.pdf

1、帕金森病(Parkinson's disease)是老年人常見的神經(jīng)遇行性疾病，該病的主要病理學特征是中腦內(nèi)多巴胺能（Dopaminergic，DA）神經(jīng)元的選擇性退變，導致紋狀體內(nèi)多巴胺含量降低，紋狀體的神經(jīng)元失去了多巴胺神經(jīng)遞質的調(diào)節(jié)作用，從而引起震顫麻痹等錐體外系運動障礙。隨著我國老齡社會的來臨，該病的發(fā)病率逐年升高，嚴重影響病人的生活質量，并給家庭及社會帶來沉重負擔，探求帕金森病的致病機制進而尋找有效治療辦法是社會的迫切需求。<

2、br>　　 研究帕金森病的核心問題就是闡明該病的發(fā)病機理，從而實現(xiàn)針對性防治。多年的研究表明，遺傳及環(huán)境多種因素均與帕金森病有關，國內(nèi)外學者提出了遺傳因素學說、氧化應激學說及鐵代謝學說等，上述不同致病因素均是引發(fā)中腦多巴胺能神經(jīng)元的選擇性退變而導致帕金森病的。中腦多巴胺神經(jīng)元及其向紋狀體靶向投射的異常是導致帕金森病的神經(jīng)解剖學基礎，也是研究帕金森病最本質的問題。
　　 新近有研究指出，軸突導向分子EphA5可能與中腦DA神經(jīng)元

3、軸突的靶向生長相關；免疫組織化學染色也顯示，中腦DA神經(jīng)元大都同時表達酪氨酸羥化酶(TH)和EphA5。作為軸突導向分子的EphA5與紋狀體細胞表達的EphA5配體的結合可能是DA神經(jīng)元軸突向紋狀體生長的重要機制?；谶@種理念，我們設計了這一實驗：
　　 (1)以中腦神經(jīng)上皮干細胞為研究對象，應用免疫細胞化學染色、RT-PCR及Western-blot等技術方法檢測了EphA5在中腦神經(jīng)上皮干細胞中的表達狀況和其配體Ephrin

4、-A5在紋狀體中的表達狀況；
　　 (2)為進一步檢測EphA5是否引導了中腦DA神經(jīng)元軸突向紋狀體的投射，我們在新生鼠腦紋狀體部注入綠色熒光示蹤劑，逆行標記了中腦中向紋狀體投射的那部分DA神經(jīng)元；同時應用免疫細胞化學染色檢測了中腦中綠色熒光陽性神經(jīng)元同時表達EphA5的狀況，以明確這些逆行標記的陽性DA神經(jīng)元就是EphA5陽性細胞；
　　 (3)將取自GFP轉基因鼠的中腦神經(jīng)上皮干細胞與普通鼠的紋狀體組織塊聯(lián)合培養(yǎng)，觀

5、察了細胞向紋狀體的靶向生長情況；并檢測了紋狀體提取液對中腦神經(jīng)上皮干細胞軸突生長的作用；
　　 (4)應用RNA干擾技術，沉默基因EphA5的表達，觀察干擾后的中腦神經(jīng)上皮干細胞的軸突生長情況。
　　 (1)取自胚胎中腦的神經(jīng)上皮干細胞，培養(yǎng)24h后，細胞貼壁并發(fā)出短的突起；48h后，免疫熒光染色顯示，絕大多數(shù)細胞呈TH陽性，其中部分細胞呈EphA5陽性；
　　 (2)鼠腦紋狀體區(qū)EphA5免疫熒光染色顯示，紋狀

6、體部的大多數(shù)細胞呈Ephrin-A5陽性，說明這些細胞是產(chǎn)生EphA5配體的細胞；
　　 (3)RT-PCR及Western-blotting檢測結果顯示，紋狀體組織Ephrin-A5mRNA及蛋白的表達水平均高于對照組前額葉皮質，結果有顯著性差異(P<0.01)；進一步證明了EphA5的配體來自絞狀體細胞；
　　 (4)紋狀體綠色熒光逆行示蹤和TH、EphA5免疫熒光染色結果顯示，熒光標記的神經(jīng)元大部呈TH陽性，部分呈

7、EphA5陽性，說明DA神經(jīng)元大部分投射至紋狀體，其中部分細胞表達EphA5;
　　 (5)將中腦神經(jīng)上皮干細胞與紋狀體組織塊聯(lián)合培養(yǎng)，結果顯示，培養(yǎng)l2h后，有些細胞在靠近紋狀體組織塊一側出現(xiàn)丘狀隆起；24h后，細胞伸出短突起：48h后，突起增多伸長；培養(yǎng)3d后，可見細胞在靠近紋狀體的一側伸出長的線性突起而在其它方向突起短。應用取自GFP轉基因鼠的中腦神經(jīng)上皮干細胞與普通鼠的紋狀體組織塊共培養(yǎng)，朝向紋狀體組織塊生長的突起數(shù)目及

8、長度明顯大于背向生長情況（P　　 (6) RNA干擾后的中腦神經(jīng)上皮干細胞與紋狀體組織塊聯(lián)合培養(yǎng)結果顯示，突起向紋狀體匯集的趨勢不明顯，朝向和背向紋狀體組織塊伸出的突起數(shù)目、長度無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　　 本項研究表明，中