幽門螺桿菌Ⅳ型分泌系統(tǒng)hp0527-C和hp0523基因的功能鑒定與分析.pdf

1、目的:
　　 幽門螺桿菌(Heliocbacter pylori,H.pylori)的某些毒力因子是通過Cag致病島(cag pathogenicity island,Cag-PAI)編碼的Ⅳ型分泌系統(tǒng)(typeⅣ secretion system,TFSS)轉(zhuǎn)運進入胃粘膜細胞而發(fā)揮毒性作用。目前已知幽門螺桿菌的Ⅳ型分泌系統(tǒng)蛋白的編碼基因有27種,但多數(shù)基因的功能尚未十分清楚。本文以cagY/hp0527基因和hp0523基因為

2、研究對象,探討它們在Ⅳ型分泌系統(tǒng)轉(zhuǎn)運毒力因子過程中的作用,為進一步研究Ⅳ型分泌系統(tǒng)的轉(zhuǎn)運機制和深入闡明幽門螺桿菌的致病機制奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.根據(jù)GenBank收錄的H.pylori22695全基因組序列,利用生物信息學(xué)軟件Primer Primier5.0設(shè)計擴增引物,獲取hp0527-C和hp0523基因,T-A克隆后構(gòu)建pMD18-T-hp0527-C和pGEM-T-hp0523載體,進行序列測定；

3、并對其序列進行生物信息學(xué)分析研究；
　　 2.構(gòu)建pET-28a-hp0527-C和pET-28a-hp0523原核表達載體,轉(zhuǎn)化表達宿主菌BL21(DE3)；經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,SDS-PAGE法和Western blot法鑒定表達后,并以Ni2+-NTA柱分離純化目的蛋白；進一步對純化蛋白進行生物學(xué)活性研究；
　　 3.純化后的HP0527-C融合蛋白免疫家兔,制備抗HP0527-C多克隆抗體,應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(e

4、nzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測血清抗體效價。
　　 4.HP0527-C融合蛋白與BGC-823細胞作用一定時間,提取細胞總RNA,采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測IL-8 mRNA的表達；并用四甲基偶氮唑藍(㈣檢測蛋白對BGC-823細胞增殖的影響。
　　 5.擴增獲得hp0527和hp0523基因上、下游同源臂片段F1、F2,構(gòu)建自殺質(zhì)粒pBlueKM40

5、/△hp0527::Kmr,pBlueKM40/Ahp0523::Kmr,電擊轉(zhuǎn)化H.pylori后經(jīng)抗生素篩選hp0527和hp0523基因缺失株,再進行PCR鑒定；
　　 6.采用hp0527和hp0523基因缺失株和野生株與胃癌上皮細胞BGC-823進行共培養(yǎng),而后采用Western blot法檢測CagA蛋白轉(zhuǎn)運能力變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.擴增獲得的hp0527-C基因全長1494bp,編碼498

6、aa,與根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens,A.tumefaciens)的VirB10具有較高的同源性；hp0523基因全長為510 bp,編碼169 aa,與GenBank公布的26695、J99同源性為92～95％；蛋白相對分子量Mr預(yù)測為19.7 kDa,等電點pI為9.53；蛋白二級結(jié)構(gòu)分析,在33～165位aa之間存在一個保守的SLT催化基序,第56位谷氨酸(GLU56)是催化活性的中心位點,C端序

7、列上含有一個肽聚糖結(jié)合域“AVGAY”,故預(yù)測hp0523基因可能是一個肽聚糖水解酶編碼基因；
　　 2.構(gòu)建獲得了原核表達載體pET-28a-hp0527-C和pET-28a-hp0523,IPTG誘導(dǎo)后,經(jīng)SDS-PAGE鑒定和Western blot鑒定有目的蛋白表達；采用Ni2+-NTA柱梯度洗脫后,分離獲得了目的蛋白HP0527-C和HP0523；HP0527-C融合蛋白免疫家兔,獲得抗HP0527-C多克隆抗體的效價

8、為1:1.6×104。
　　 3.終濃度10μg·ml-1的HP0527-C融合蛋白作用于胃癌上皮細胞BGC-823細胞4h后,可擴增出IL-8片段；不同濃度的HP0527-C融合蛋白與BGC-823細胞作用6、12、24及48h后,細胞增殖的程度隨著HP0527-C融合蛋白濃度的增高和作用時間的延長而逐漸降低。
　　 4.HP0523經(jīng)復(fù)性處理后,采用溶菌斑點實驗證實其具有溶菌活力；而后采用SDS煮沸法分離提取獲得細菌

9、肽聚糖,進行凝膠酶譜分析后,發(fā)現(xiàn)HP0523蛋白具有肽聚糖水解能力；理化特性研究表明,HP0523具有廣譜的溶菌能力,但酶活力較溶菌酶低；其最適酶活力pH值為6.0;
　　 5.連接F1、F2后構(gòu)建自殺質(zhì)粒pBlueKM40/△hp0527::Kmr,pBlueKM40/△hp0523::Kmr電擊轉(zhuǎn)化后經(jīng)抗生素篩選,并經(jīng)PCR驗證后獲得了hp0527和hp0523基因缺失株；缺失株、野生株分別與胃癌上皮細胞BGC-823進行共

10、培養(yǎng)后,發(fā)現(xiàn)hp0527和hp0523基因缺失株處理組,胃癌上皮細胞內(nèi)未能檢測到CagA的轉(zhuǎn)運。
　　 結(jié)論:
　　 1.本研究成功克隆了hp0527-C基因,是H.pylori cag PAI編碼的TFSS的結(jié)構(gòu)基因之一。構(gòu)建了原核表達載體,獲得了HP0527-C融合蛋白,其融合蛋白可誘導(dǎo)胃癌上皮細胞BGC-823細胞表達IL-8 mRNA,24h表達量最高,同時對細胞的增殖有一定抑制作用。
　　 2.本研究結(jié)