硼替佐米耐藥骨髓瘤細胞株的建立及其耐藥機制研究.pdf

1、目的和意義： 多發(fā)性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)是最為常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤之一，發(fā)生率占血液系統(tǒng)惡性腫瘤的10％左右，隨著人口的老齡化，該病的發(fā)生率在我國呈逐年增高的趨勢。目前，所有的治療手段包括化療、放療、造血干細胞移植以及一些新型的分子靶向藥物。但迄今為止MM仍是一種不可治愈性疾病。研究顯示，蛋白酶體抑制劑硼替佐米(Bortezomib/PS-341，商品名VElCADE(R))可誘導包括地塞米松、美法

2、侖以及沙利度胺耐藥刪細胞在內的MM細胞產生凋亡，已在刪的治療中顯示出了較好的療效。其主要作用機制為通過靶向性作用于泛素-蛋白酶體系統(tǒng)，抑制核因子κ B(nuclear factor-kappa B，NF-κB)的活性以發(fā)揮抗腫瘤作用。 硼替佐米為哺乳動物細胞中26S蛋白酶體糜蛋白酶樣活性的可逆抑制劑，化學名為：[(1R)-3-甲基-1[[(2S)-1氧-3-苯基-2-[(吡嗪羧基)氨基]丙基]氨基]丁基]硼酸，分子式C19H25

3、BN404，相對分子量384.24。它是首個獲美國FDA批準用于MM臨床治療的蛋白酶體抑制劑，具有特異性強效、高效的特點。Mateos等報道，采用硼替佐米聯合MP(VMP方案)治療60例65歲及以上的老年初診MM患者，總反應率為89％，CR率為32％，16個月的無事件生存率(EFS)為93％；而歷史對照的MP方案總反應率為42％，16個月的EFS為51％。2008年NCCN骨髓瘤診療指南中也推薦將VD(硼替佐米+地塞米松)、PAD(硼替

4、佐米+地塞米松邯可霉素)、MPV(美法侖+強的松+硼替佐米)用于初發(fā)及移植候選的MM患者。對于難治/復發(fā)的MM患者2008年NCCN指南中將硼替佐米單藥及硼替佐米聯合脂質體阿霉素作為Ⅰ類推薦，硼替佐米+地塞米松方案作為2A類推薦。 然而，硼替佐米尚不能根治MM，且隨著其臨床應用范圍的擴大和時間的推移，國內外臨床研究已發(fā)現部分刪患者對硼替佐米產生了耐藥反應或在初期治療有效的MM患者中出現耐藥及疾病的復發(fā)，從而影響了硼替佐米的療效。

5、目前，研究發(fā)現MM患者中硼替佐米耐藥主要與NF-κ B途徑、熱休克蛋白及BCL蛋白家族的過表達現象有關。因此，繼續(xù)尋找有效方案以預防耐藥的發(fā)生或根除惡性漿細胞克隆，是目前研究的一個熱點。 目前，國內外關于硼替佐米的耐藥機制研究尚少，其耐藥機制尚不明確。有研究國外分析了多藥物耐藥蛋白(MRP)在刪細胞中的表達與硼替佐米誘導MM細胞凋亡間的相關性，研究顯示MRP3和MRP5的表達不足以遏制硼替佐米誘導產生的凋亡作用，從而提示硼替佐米

6、可能并非為多藥耐藥轉運蛋白的底物。這就提示，硼替佐米的耐藥不同于現有腫瘤治療中經典的多藥耐藥。 因此，如果能建立硼替佐米耐藥的MM細胞株，可以深入研究硼替佐米可能的耐藥機制，為臨床應用蛋白酶體抑制劑治療MM，監(jiān)測和避免治療中耐藥的發(fā)生提供實驗依據；同時，為抗耐藥藥物的篩選提供細胞模型，以期達到逆轉耐藥提高療效的目的。為此，本研究擬通過建立硼替佐米耐藥的刪細胞株，對其進行基因組學及差異蛋白組學的研究以期初步探討其可能的耐藥機制，為

7、臨床克服硼替佐米耐藥提供細胞模型及實驗依據。本研究包括以下兩個部分： 第一部分硼替佐米耐藥骨髓瘤細胞株的建立及其基因表達譜研究 方法：采用濃度遞增的方法自MM細胞系NCI-H929建立了硼替佐米耐藥株NCI-H929B。MTT實驗測得硼替佐米對親本NCI-H929和NCI-H929B24h的IC50值。流式細胞術分析兩種細胞的細胞周期分布情況。提取NCI-H929、NCI-H929B兩種mRNA分別變性及逆轉錄至cDNA

8、，進行基因表達譜分析。對基因表達譜數據，進行GO-分析和Pathway-分析，從中發(fā)現可能與耐藥相關的信號通路，及其相互激活關系。采用實時定量PCR技術，對重要通路上相關基因(Casp7、TRAF2、FADD、Casp8，MAP3K5、Hsp86)進行驗證。并選取Caspase8抑制劑進行干預，檢測親本NCI-H929細胞系對硼替佐米的IC50變化情況。 結果：采用濃度遞增法自MM細胞系NCI-H929建立了硼替佐米耐藥株NCI

9、-H929B。MTT實驗測得硼替佐米對親本NCI-H929和NCI-H929B24h的IC50分別為20.7nmol/L和487.4nmol/L，耐藥倍數為23.5。流式細胞術分析顯示親本NCI-H929和NCI-H929B的細胞周期分布無顯著性差異。 提取親本NCI-H929、NCI-H929B兩種mRNA分別變性及逆轉錄至cDNA，進行基因表達譜分析，結果顯示與親本NCI-H929相比，在NCI-H929B中有317個基因表

10、達上調，而356個基因表達下調。對基因表達譜數據，進行GO-分析和Pathway一分析，從中發(fā)現可能與耐藥相關的信號通路，及其相互激活關系，結果提示凋亡通路、細胞周期等信號通路可能與硼替佐米耐藥的產生相關。采用實時定量PCR技術，對重要通路上相關基因(Casp7、TRAF2、FADD、Casp8，MAP3K5、Hsp86)進行驗證。當候選基因在耐藥株中表達/親本細胞中表達≥1.5時，則認為該基因為過表達，若是≤0.5則判定該基因為低表達

11、，結果顯示在NCI-H929B細胞株中FADD、Casp8，MAP3K5表達下調，而Hsp86表達上調。采用Caspase8抑制劑進行干預，檢測親本NCI-H929細胞系對硼替佐米的IC50變化情況，結果顯示加入抑制劑后，NCI-H929細胞系對硼替佐米的IC50增高4.37倍。 結論：通過體外濃度遞增法可建立蛋白酶體抑制劑硼替佐米耐藥的MM細胞株。親本NCI-H929和NCI-H929B的生長曲線和細胞周期分布無顯著性差異?；?/p>

12、因表達譜及Pathway分析顯示親本NCI-H929和NCI-H929B細胞系間存在多個差異表達基因，而凋亡、細胞周期通路在耐藥的產生中可能起著重要作用。Caspase8的表達受抑制可能是耐藥細胞株產生耐藥的重要因素之一。 第二部分硼替佐米敏感與硼替佐米耐藥骨髓瘤細胞差異蛋白質組學研究 方法：提取NCI-H929、NCI-H929B兩種細胞的蛋白，采用雙向電泳及質譜鑒定技術，分析差異蛋白的表達情況。并選取其中部分差異蛋白

13、，采用western-blot技術進行驗證。留取臨床患者原代標本，進行western-blot檢測，進一步驗證雙向電泳結果，并分析差異蛋白與硼替佐米耐藥的相關性。 結果：通過雙向電泳及質譜鑒定后共鑒定出14個差異蛋白，與親本NCI-H929細胞相比，在NCI-H929B中上調的蛋白質點有11個，分別為HSP75、α烯醇化酶、蛋白二硫化物異構酶A3、磷酸化應激誘導蛋白1、膜聯蛋白A1、脫氧核糖核酸酶TATDN1、HSPβ-1、蛋白

14、DJ-1、微管蛋白β-6、角蛋白KRT1、加帽蛋白Zβ；下調的蛋白質點有3個，分別為腺苷高半胱氨酸水解酶、ATP合成酶β亞單位和Rho-GDP解離抑制因子β。通過western Blot技術檢測了在NCI-H929B雙向電泳中顯示為高表達的蛋白DJ-1，結果顯示NCI-H929B中蛋白DJ-1表達水平增高。采用CD138磁珠分選技術獲得7名MM患者的原代刪細胞標本，通過western Blot技術檢測顯示硼替佐米耐藥的原代刪細胞標本中蛋