TTRAP影響腫瘤細胞生長和依托泊苷藥物敏感性的分子機理初步研究.pdf

1、DNA損傷修復與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，其中的關鍵分子和信號通路是抗腫瘤藥物研究和開發(fā)的重要靶點。TTRAP(TRAF and TNF receptor-associatedprotein)是一個新鑒定的5'-酪氨酰DNA磷酸二酯酶，在細胞發(fā)生DNA損傷時，可將雙鏈斷裂缺口處5'端的磷酯酪氨酰鍵水解轉化為5'磷酸，促進DNA雙鏈斷裂修復。本論文旨在研究TTRAP對腫瘤細胞生長和化療藥物敏感性的影響，探討其能否作為腫瘤輔助治療的靶標。<

2、br>　　為確定TTRAP是否與腫瘤發(fā)生有關，我們檢索了TTRAP在基因表達綜合庫中的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在早期發(fā)病的結直腸癌患者結腸黏膜和惡性轉化的前列腺癌患者腫瘤內TTRAP表達量均較低。檢測肺癌、乳腺癌、前列腺癌及骨肉瘤等多種腫瘤細胞株的TTRAP蛋白表達譜，發(fā)現(xiàn)TTRAP在所有細胞中普遍存在，但其表達形式和表達豐度在各細胞株中存在較大差異。
　　在內源TTRAP表達量相對較低的人骨肉瘤細胞株U2OS中，過表達野生型TTRAP(TTR

3、AP wild type，TTRAPwt)顯著抑制U2OS細胞的克隆形成。穩(wěn)定轉染TTRAP的細胞株在持續(xù)6天的生長曲線中顯示生長變緩。表達TTRAP酶活性的無功能突變體TTRAP(E152A)及TTRAP(D262A)可部分緩解這種抑制作用。TTRAPwt的過表達對NF-κ B的轉錄活性有抑制作用，該作用可被突變體TTRAP(E152A)及TTRAP(D262A)的表達所抵消。TTRAP也可抑制U2OS細胞遷移，但TTRAP酶活性的突

4、變對這一作用沒有影響。上述結果提示TTRAP對腫瘤細胞有生長抑制作用，這種抑制作用依賴于其5，-酪氨酰DNA磷酸二酯酶活性，可能與NF-κ B信號通路相關。
　　TP53是DNA損傷反應中決定細胞命運的關鍵蛋白。為探討TTRAP影響腫瘤細胞生長的分子機制，我們應用酵母雙雜交鑒定了TTRAP與TP53的直接相互作用。TP53的截短突變體與TTRAP的酵母配對實驗結果表明，TP53的DNA結合域與兩者間的相互作用有關。免疫共沉淀實驗證

5、實293T細胞內源表達的TP53和TTRAP存在相互作用。熒光蛋白融合體EGFP-p53和TTRAP-DsRed可共定位于細胞核內，表明TTRAP和TP53在空間上存在相互作用的可能。應用螢光素酶報告基因檢測TP53對下游靶基因的轉錄調控作用，在低水平表達TP53的情況下，TTRAP促進TP53對下游基因的轉錄激活作用。
　　依托泊苷是臨床常用的抗腫瘤藥物，通過干擾拓撲異構酶2(topisomerase2，Top2)介導的DNA再

6、連接反應使DNA雙鏈斷裂。體外藥物敏感性研究表明，U2OS細胞過表達TTRAPwt后，依托泊苷處理使其克隆存活率顯著高于空載體對照;細胞內源TTRAP用siRNA沉默表達，藥物處理后的克隆存活率低于對照。在細胞增殖實驗中，U2OS細胞過表達TTRAPwt后對依托泊苷的細胞毒效應低于空載體對照，而過表達TTRAP(E152A)和TTRAP(D262A)后其效應高于對照。這表明TTRAP的表達量與U2OS細胞對依托泊苷的藥物敏感性呈負相關。

7、
　　為進一步探討TTRAP與依托泊苷細胞殺傷效應的相關性，我們檢測了藥物處理情況下TTRAP轉錄和蛋白表達的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)依托泊苷處理1～6小時內TTRAP的轉錄沒有顯著提高，但其蛋白量有所增加。以亞胺環(huán)己酮(cycloheximide，CHX)抑制細胞內蛋白質合成時，TTRAP的蛋白表達量在1～9小時內逐漸減少，而同時加CHX和依托泊苷處理，細胞內TTRAP蛋白降解速度減緩，表明依托泊苷處理提高了TTRAP蛋白的穩(wěn)定性，減緩了

8、蛋白的降解過程。因翻譯后修飾（post-translational modifications，PTM），如泛素化和SOMO化情況的變化會影響蛋白穩(wěn)定性，依托泊苷對TTRAP蛋白穩(wěn)定性的影響可能涉及蛋白的泛素化抑制和SOMO化激活，其具體機理還需要進一步實驗驗證。SUMO非共價結合也屬于蛋白翻譯后修飾的一種。將TTRAP基因中的SUMO蛋白非共價結合位點突變后與紅熒光基因融合后構建成融合蛋白表達質粒pTTRAP(SIMm)-DsRed，

9、該質粒在細胞內的表達量顯著下降，且不再呈現(xiàn)PML核體典型的點狀分布特征，說明SUMO蛋白的結合對TTRAP蛋白在細胞內的穩(wěn)定表達和亞細胞定位起著重要作用。
　　綜上所述，本論文發(fā)現(xiàn)了TTRAP對U2OS腫瘤細胞的生長有抑制作用，U2OS細胞對抗腫瘤藥物依托泊苷的敏感性與TTRAP的表達量呈負有關。上述結果表明對TTRAP表達和活性的調節(jié)有助于改善腫瘤細胞對依托泊苷的藥物敏感性，為TTRAP應用于腫瘤的輔助治療提供了初步的實驗和理論