結(jié)核分枝桿菌琥珀酰輔酶A合成酶的克隆表達及其性質(zhì)研究.pdf

1、結(jié)核分枝桿菌是人類死亡的頭號殺手，嚴重影響著人類健康。隨著廣譜耐藥性的出現(xiàn)，其威脅將越來越嚴峻，開發(fā)新的結(jié)核病治療靶標迫在眉睫。結(jié)核分枝桿菌的新陳代謝必須適應胞內(nèi)環(huán)境才可能在人巨噬細胞中生存，然而人類對于結(jié)核分枝桿菌在宿主細胞和組織的生存過程中的代謝相關知識了解甚少，尤其是核心的中間物代謝。檸檬酸循環(huán)是新陳代謝的中心環(huán)節(jié)。它既是絕大多數(shù)生物體主要的分解代謝途徑，也是準備提供大量自由能的重要代謝系統(tǒng)，在合成代謝中都以該循環(huán)的中間產(chǎn)物為生物

2、合成的前體來源。琥珀酰輔酶A合成酶(succinyl-CoA synthetase，SCS)(EC 6.2.1.5)是檸檬酸循環(huán)的重要組成成分，催化該循環(huán)中唯一發(fā)生底物水平磷酸化的步驟，這一反應是可逆的：琥珀酰輔酶A+NDP+P(i) 盤琥珀酸鹽+CoA+NTP(N指代腺苷酸或鳥苷酸)。SCS由α和β兩種亞基構成。本實驗室的前期研究，利用雙向電泳技術對貓爪草提取物作用前后的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株的全細胞蛋白表達圖譜進行差異比較和分析，發(fā)

3、現(xiàn)琥珀酰輔酶A合成酶的編碼基因(Rv0951)在貓爪草作用后其表達明顯下調(diào)。本文在此基礎上展開研究，以期這部分工作能有助于結(jié)核病治療靶標的開發(fā)。 本研究用PCR技術從結(jié)核分枝桿菌基因組DNA中擴增了編碼琥珀酰輔酶A合成酶α和β亞基的兩個基因(SucD和SucC)，其大小分別為1000 bp和1200 bp左右。將PCR產(chǎn)物分別連入載體pET28a(+)和pET32a(+)中，經(jīng)菌落PCR、質(zhì)粒PCR、質(zhì)粒酶切以及序列測定證明成功

4、構建了重組質(zhì)粒pSCSa-pET28和pSCSp-pET32。 pET28a(+)和pET32a(+)分別帶有卡那霉素抗性標記和氨芐青霉素抗性標記，兩重組質(zhì)粒便具有了相應的篩選標記。兩重組質(zhì)粒分別或同時轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導后均可見重組蛋白可溶形式的表達。重組菌經(jīng)搖瓶培養(yǎng)后，離心收集菌體，超聲波破碎，取上清進行親和純化。純化后的蛋白用于圓二色譜和酶活分析。 用圓二色譜儀分析重組蛋白的二級結(jié)構，將其與在

5、線軟件(http：//www.Predictprotein.org)預測的結(jié)核分枝桿菌SCSa和SCSp的結(jié)構進行了比較。SCS的生物學活性結(jié)構存在兩種不同的形式：哺乳動物線粒體的SCS僅僅以αβ二聚體發(fā)揮功能，大腸桿菌中則以(αβ)<,2>四聚體的形式發(fā)揮活性。本文以大腸桿菌SCSa和SCSp的晶體結(jié)構作為模板探討了結(jié)核分枝桿菌SCSa和SCSB的三級結(jié)構，發(fā)現(xiàn)這兩個物種的SCSa和SCSp結(jié)構都非常相似，推測結(jié)核分枝桿菌發(fā)揮其生物學

6、功能的SCS結(jié)構與大腸桿菌的一致。酶活分析表明共轉(zhuǎn)pSCSa-pET28和pSCSβ-pET32的重組菌的純化蛋白具有SCS的催化活性，即：將琥珀酸鹽和CoA轉(zhuǎn)化為琥珀酰輔酶A。 由于SCS催化琥珀酸輔酶A與琥珀酸的相互轉(zhuǎn)化是一個可逆過程，極易向正反兩個方向進行。本文用HPLC探討了SCS兩個亞基不同的表達水平對宿主產(chǎn)生琥珀酸的影響，所用菌株為：①表達宿主菌BL21(DE3)；②表達pET28a(+)載體蛋白的BL21(DE3)

7、；③表達pET32a㈩載體蛋白的BL21(DE3)；④表達SCSa融合蛋白的BL21(DE3)；⑤表達SCSβ融合蛋白的BL21(DE3)；⑥同時表達SCSa融合蛋白和SCSβ融合蛋白的BL21(DE3)。發(fā)現(xiàn)①②③誘導前后琥珀酸的含量都較高(10 g/L～20 g/L)；④⑤⑥誘導前后琥珀酸的含量都較低(0.48g/L～10 g/L)，其中④經(jīng)誘導后琥珀酸的產(chǎn)量為誘導前的5～17倍，⑤經(jīng)誘導后琥珀酸的產(chǎn)量為誘導前的0.9～3.9倍，⑥

8、經(jīng)誘導后琥珀酸的產(chǎn)量為誘導前的0.56～1.09倍。說明SCS的任何一個亞基的過量表達都有助于琥珀酸的積累，而兩個亞基都同時過量表達卻有利于琥珀酸轉(zhuǎn)化為琥珀酰輔酶A。琥珀酰輔酶A為許多化合物合成的重要中間產(chǎn)物，它還參與厭氧菌特有的烴類降解的代謝過程中的第六步：苯甲酰琥珀酰輔酶A分解成苯甲酰輔酶A和琥珀酰輔酶A，后者又參與第二步反應把輔酶A轉(zhuǎn)移到苯甲酰琥珀酸上，形成循環(huán)。潛伏期結(jié)核菌可能啟動類似的代謝機制應對低氧或缺氧環(huán)境，但目前尚未見相