HDAC抑制劑抗腫瘤效應靶基因的研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：SMART技術篩選HDAC抑制劑誘導腫瘤細胞凋亡靶基因的研究
　　 目的:
　　 通過建立一種全新的、基于基因功能的篩選手段——SMART（Suppression of Mortality by Antisense Rescue Technique）技術，尋找抵抗HDAC抑制劑誘導腫瘤細胞凋亡的效應基因并初步探討其作用機制。
　　 方法:
　　 250 nmol

2、/L TSA誘導乳腺癌細胞MCF-7凋亡，并收集處于凋亡不同時段的細胞提取mRNA，構建反義cDNA文庫。文庫DNA隨機轉入HeLa細胞中，篩選出陽性轉染細胞克隆，存活克隆經擴增后提取Hirt DNA，轉化感受態(tài)細菌并測序。經生物信息學分析后選擇感興趣的基因進行功能驗證，并進一步探討其作用機制。
　　 結果:
　　 成功構建反義cDNA文庫，片段插入率大于90%，平均長度約為1.5kb，庫容約為2×105；運用NCBI

3、blast比對獲得76個EST片段；再次重復篩選驗證，選定LIV-1基因進行進一步研究。實驗顯示，HDAC抑制劑可以選擇性誘導腫瘤細胞中LIV-1基因的表達，平板克隆形成實驗、MTT實驗和FACS檢測凋亡實驗顯示下調LIV-1表達可以抵抗HDAC抑制劑誘導的細胞凋亡，這一效應可能與封閉LIV-1后腫瘤細胞內鋅離子穩(wěn)態(tài)被破壞有關。
　　 結論:
　　 SMART技術作為一種基于基因功能的篩選手段，可以高通量、特異性的獲得在

4、HDAC抑制劑誘發(fā)細胞凋亡過程中的效應基因；基因LIV-1可能是HDAC抑制劑抗腫瘤效應的靶基因，下調LIV-1表達可抵抗HDAC抑制劑誘導腫瘤細胞凋亡，這一效應可能與封閉LIV-1后腫瘤細胞內鋅離子穩(wěn)態(tài)被破壞有關。
　　 第二部分：粘附分子CD146在HDAC抑制劑抗腫瘤效應中的保護作用及機制研究
　　 背景和目:的研究表明，在HDAC抑制劑的作用下，細胞中占總數17%的基因轉錄水平會發(fā)生變化。如此廣泛的作用靶點使得H

5、DAC抑制劑在啟動某些治療性反應的同時也啟動了某些意想不到的保護性程序，后者嚴重影響到HDAC抑制劑的最佳臨床療效。目前臨床上由于HDAC抑制劑單藥用藥治療效能較低，僅被作為輔助用藥，與一些傳統(tǒng)的一線化療藥聯用，達到增強療效的目的。因此，揭示其低效能背后暗藏的分子機制對推動該類治療性藥物的臨床應用具有重要意義。
　　 方法和結果:
　　 通過cDNA芯片分析，我們發(fā)現HDAC抑制劑作用后細胞內大量粘附分子表達上調，其中以

6、粘附分子CD146的上調最為顯著。以CD146為代表，通過Realtime PCR、Western blot和免疫組化等方法證實了，在HDAC抑制劑的作用下，多種腫瘤細胞系、原代腫瘤細胞和動物體內CD146被明顯上調。將CD146的單克隆抗體與HDAC抑制劑聯用顯著增強了HDAC抑制劑的促進凋亡和抑制血管生成的作用，從而抑制腫瘤惡性生長與轉移。其作用機制可能與下調PI3K/AKT/mTOR通路的活性有關。
　　 結論: