環(huán)境脅迫對長春花TIAs生物合成的調控及相關基因表達分析.pdf

1、生物堿（Alkaloids）是植物天然次生代謝產(chǎn)物中數(shù)量最多的一類含氮堿性化合物。許多生物堿由于具有特殊的藥理學活性已引起人們越來越多的關注。長春花(Catharanthusroseus)中含有長春堿(Vinblastine，VBL)、長春新堿(Vincristine，VCR)等重要的抗腫瘤萜類吲哚生物堿（Terpenoid indole alkaloids，TIAs），成為近年來生物制藥領域的熱點，并被確定為研究植物次生代謝的模式植物

2、。
　　長春花為喜光性植物，性喜高溫高濕，耐半陰。近年來，不少學者從改變長春花的環(huán)境因素方向進行研究，發(fā)現(xiàn)長春花植株體中吲哚生物堿的積累量的高低和環(huán)境因子有關。光和干旱脅迫等環(huán)境因子改變TIA生物合成和積累過程中的代謝流向，但從生物堿合成的環(huán)境調控機理和相關因表達影響方面研究比較少，本文一方面利用紅色遮光膜遮蔭的方法，對長春花的無菌苗進行處理，檢測葉片中色素含量和生物堿含量變化以及生物堿合成相關基因的表達，探討葉綠素含量變化和相關

3、基因表達與生物堿積累的關系。采用同樣的紅膜遮蓋處理長春花實生苗，對葉片色素含量和生物堿合成相關基因表達的分析，以及生物堿含量測定，綜合兩種處理，闡明光質和光強對長春花生物堿積累的調控機理;另一方面，運用植物生理生態(tài)學理論和方法，研究長春花在6種不同濃度PEG6000模擬干旱脅迫下的脯氨酸含量和葉片相對含水量的變化情況，進而在優(yōu)化PEG6000模擬干旱脅迫下，研究葉片POD活性、生物堿含量和相關基因的表達，并且分析與細胞壁降解相關的果膠甲

4、基酯酶(Pectin methylesterase，PME)的基因的表達變化，探討滲透脅迫對生物堿合成的調控機理。
　　主要實驗結果如下：
　　(1)通過HPLC方法測定紅膜處理長春花無菌苗和對照葉片中生物堿含量，文多靈(Vindoline，VIN)和長春質堿（Catharanthine，CAT）的含量緩慢上升后逐漸下降，并且低于對照;耦合VIN和CAT的產(chǎn)物VBL含量均逐漸高于對照，在處理第15天達到最高，通過SQ-RT-

5、PCR測定長春花生物堿代謝途徑中5個關鍵基因的表達水平，通過Quantify One軟件數(shù)量化電泳結果，數(shù)據(jù)分析表明低光環(huán)境對G10h基因表達影響不明顯，相關性分析得出D4h和Dat基因表達水平較好的反映TIA合成路徑的文多靈的積累，Tdc和Str基因表達水平較好的反映長春質堿積累，調控是在轉錄水平發(fā)生。因此在研究工作中，通過分析關鍵基因的表達水平快速準確地推測長春花中對應生物堿的含量。
　　(2)相同的紅色濾光膜遮光處理長春花實

6、生苗，綜合分析兩種處理低光環(huán)境下的光質和光強，透過膜的光強下降幅度基本相同。在一定時間Tdc， Str，D4h和Dat基因表達與對應的VIN和CAT的含量有相關性。紅膜誘導的低光環(huán)境，一定時間有利于VIN和CAT含量合成和積累。對比兩種環(huán)境下色素含量:類胡蘿卜素含量和葉綠素含量變化明顯不同，推測調節(jié)長春花體內激素含量變化，因而影響長春堿的生物合成。
　　(3)通過6種不同濃度PEG6000脅迫處理長春花，通過茚三酮比色法測定脯氨酸

7、含量，測定葉片相對含水量，結果表明:相同濃度PEG6000處理下，隨著脅迫時間的延長，葉片相對含水量下降——上升的趨勢和脯氨酸含量緩升——急升的趨勢。相同時間下，隨著PEG濃度增強，葉片相對含水量和脯氨酸含量變化的差異越顯著，綜合二因素的差異顯著分析，本研究選擇35％PEG6000模擬干旱脅迫處理長春花。
　　(4)35％濃度PEG6000模擬干旱脅迫長春花幼苗，葉片中POD活性逐漸增強，有利于VIN和CAT向VBL的合成。干旱脅

8、迫下，長春花葉片中的文多靈含量和長春質堿含量下降，長春堿含量逐漸升高24 h達到峰值。說明POD受滲透脅迫的影響，活性增強，調節(jié)單吲哚生物堿向雙吲哚生物堿的轉化。在一定時間Tdc，Str和Dat基因的轉錄水平的積累，對應的酶將被激活，進一步反映了基因表達與對應的單吲哚生物堿生物堿之間的相關性，確定TIAs生物合成和積累代謝瓶頸，對更好的開發(fā)利用長春花的藥用資源有很大的實踐意義和理論價值。
　　(5)細胞壁是植物細胞最基本的組成結構