TORC1、phospho-CREB和BDNF在實(shí)驗(yàn)性大鼠腦梗死模型中的動(dòng)態(tài)表達(dá)及丹參酮ⅡA腦保護(hù)作用的研究.pdf

1、目的:缺血性腦血管病是常見(jiàn)病、多發(fā)病,病死率和致殘率均較高,需要細(xì)胞啟動(dòng)多種防御機(jī)制,提高抗凋亡及修復(fù)能力,以保護(hù)神經(jīng)元免受由此帶來(lái)的損傷。目前已知一些轉(zhuǎn)錄因子與神經(jīng)細(xì)胞的存活相關(guān),其中最重要的是環(huán)單磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element bindingprotein,CREB)家族。CREB在神經(jīng)系統(tǒng)中的功能實(shí)現(xiàn),最終依賴于其下游基因在時(shí)間和空間上精確的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。這些基因廣泛參與突觸傳遞、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、信

2、號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)錄以及代謝等多方面。在一些腦缺血及再灌注模型中,多種應(yīng)激刺激通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑使CREB第133一位的絲氨酸磷酸化而激活。磷酸化的CREB(phosphorylated CREB,phospho-CREB)直接或間接激活相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而表達(dá)某些蛋白分子如c-fos、bcl-2以及某些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Brain-Derived Neurotrophic Factor,BDNF

3、)等。這些基因產(chǎn)物調(diào)節(jié)著神經(jīng)元在應(yīng)激性損傷后的再生、存活和修復(fù)。盡管CREB可以和其靶基因結(jié)合并激活其表達(dá),但激活效應(yīng)活性較低,往往需要和一些共激活因子相互作用協(xié)調(diào)發(fā)揮激活效應(yīng)。CREB活性調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)導(dǎo)子(Transducerso0f regulated CREB,TORCs)是新發(fā)現(xiàn)的一類強(qiáng)有力的CREB的共激活因子。近年來(lái),其對(duì)CREB/BDNF通路的調(diào)控作用己成為熱點(diǎn)之一。它主要受胞內(nèi)Ca2+和cAMP的雙重調(diào)節(jié),促進(jìn)了CREB下游基

4、因轉(zhuǎn)錄的效率和突觸傳遞中的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)。因此,TORC1作為TORCs的一個(gè)亞型,在缺血性腦血管病中是否同CREB一起共同實(shí)現(xiàn)其神經(jīng)保護(hù)作用,有待進(jìn)一步研究,并挖掘其潛在的優(yōu)勢(shì)。
　　 丹參酮Ⅱ A(TanshinoneⅡA,TSA)是臨床上常用的中草藥丹參的一種脂溶性有效成分,除了對(duì)心肌、腦血管和肝臟的抗炎、抗氧化作用以外,還以其類雌激素生物效治療更年期綜合征等。
　　 本實(shí)驗(yàn)基于成功建立大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞模型,在此

5、基礎(chǔ)上:①測(cè)定腦缺血急性期不同時(shí)間點(diǎn)大鼠缺血腦皮質(zhì)中TORC1、phospho-CREB及BDNF的表達(dá)水平,以進(jìn)一步探索TORC1在腦缺血后通過(guò)phospho-CREB在促進(jìn)下游基因表達(dá)中的調(diào)節(jié)作用；②通過(guò)丹參酮Ⅱ A的應(yīng)用,觀察其對(duì)腦含水量、神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死體積及TORC1、phospho—CREB及BDNF表達(dá)的影響,從而探討TORC1、phospho-CREB及BDNF的表達(dá)與腦保護(hù)作用之間的關(guān)系,及丹參酮ⅡA腦保護(hù)作用

6、的可能機(jī)制,為臨床治療提供更為有利的理論依據(jù)。
　　 方法:實(shí)驗(yàn)分為兩部分:實(shí)驗(yàn)一,TORC1、phospho-CREB及BDNF在大鼠腦組織中的動(dòng)態(tài)表達(dá)。實(shí)驗(yàn)二,丹參酮Ⅱ A的腦保護(hù)作用研究。實(shí)驗(yàn)一,采用成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠,隨機(jī)分為正常組(normal)和模型組(middle cerebral artery was occluded,MCAO),參照Longa等的線栓法制作大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞模型,

7、分別在術(shù)后3 h,6 h,12 h,24 h,48 h,72 h進(jìn)行評(píng)分,2、3、4或5分者納入實(shí)驗(yàn)組,評(píng)分完畢將動(dòng)物斷頭處死,留取病變側(cè)腦組織,利用免疫組織化學(xué)和蛋白印跡法方法測(cè)定TORC1、phospho-CREB及BDNF在蛋白水平的動(dòng)態(tài)表達(dá)。實(shí)驗(yàn)二,采用成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠,隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham)、溶劑對(duì)照組(vehicle-control)、丹參酮Ⅱ A小劑量(10 mg/kg)組(TSA—L)及

8、丹參酮Ⅱ A大劑量(20 mg/kg)組(TSA-H)。MCAO術(shù)后立刻腹腔注射丹參酮Ⅱ A溶液(10 mg/kg或20 mg/kg),分別在術(shù)后24 h時(shí)進(jìn)行評(píng)分,完畢將動(dòng)物斷頭處死,留取病變側(cè)腦組織進(jìn)行腦含水量測(cè)定,采用2％2,3,5-三苯基四唑氮紅(triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色觀測(cè)梗死體積,免疫組織化學(xué)、蛋白印跡法(Western Blot法)和半定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)法(RT-PCR方

9、法)測(cè)定TORC1、phospho-CREB及BDNF的表達(dá)情況,以及應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀測(cè)TORC1在不同組間腦皮質(zhì)神經(jīng)元的表達(dá)和核轉(zhuǎn)導(dǎo)。
　　 結(jié)果:
　　 1 MCAO組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)TORC1、phospho-CREB及BDNF的表達(dá),均分別有兩個(gè)高峰,第一個(gè)高峰均在腦缺血后3 h,phospho—CREB及BDNF的第二個(gè)高峰在缺血后72 h,TORC1的表達(dá)和核轉(zhuǎn)錄的第二個(gè)高峰在缺血后48 h。與normal

10、組相比,TORC1,phospho—CREB和BDNF高峰時(shí)的表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　 2神經(jīng)功能評(píng)分:實(shí)驗(yàn)二中,MCAO后24 h采用改良的6分法進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分。與vehicle—control組相比TSA-H組明顯改善了神經(jīng)功能癥狀缺損(P<<0.05),TSA-L組中沒(méi)有觀測(cè)到如此明顯的結(jié)果。
　　 3腦組織含水量測(cè)定:sham組為78.50％±0.7％,vehicle—control組為84.5

11、7％±0.51％,與其相比,TSA-H組降低了腦組織含水量(82.16％±0.63％),且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。而TSA-L組與對(duì)照組比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 4梗死體積的測(cè)定:與vehicle-control組(％HLV:43.54％±3.22％)相比,TSA-H組明顯降低了梗死體積(％HLV:34.49％±1.39％),且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；TSA-L組與vehicle—control組相

12、比,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 5丹參酮ⅡA對(duì)TORC1、phospho-CREB及BDNF表達(dá)的影響:與Vehicle組相比,TSA—H組中TORC1、phospho-CREB及BDNF在蛋白水平表達(dá)明顯升高(P<0.05),尤其是TORC1的核積累顯著增加,同樣,TORC1及BDNF在mRNA水平表達(dá)也明顯升高(P<0.05)；而TSA-L組表達(dá)無(wú)此明顯差異。激光共聚焦顯微鏡技術(shù)顯示:與Vehicle組比較,TSA

13、—H組中TORC1在神經(jīng)元胞核和細(xì)胞質(zhì)中的聚集反應(yīng)顯著增加。
　　 結(jié)論:TORC1、phospho-CREB及BDNF在大腦中動(dòng)脈閉塞后早期被誘導(dǎo)表達(dá),TORC1可能僅在腦缺血后48 h前參與了促進(jìn)了phospho-CREB/BDNF通路的活化。高劑量丹參酮ⅡA干預(yù)后,腦含水量降低,梗死體積減小,神經(jīng)功能癥狀缺損評(píng)分降低,上調(diào)了TORC1、phospho-CREB及BDNF的表達(dá)水平,對(duì)腦缺血后腦組織有保護(hù)作用。本研究提示TO