RNA干擾VEGF-A--C對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：構(gòu)建同時(shí)表達(dá)VEGF-A和VEGF-C的短發(fā)夾RNA真核表達(dá)載體，并通過(guò)其介導(dǎo)的RNA干擾作用，研究對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株IGR-N-91細(xì)胞中VEGF-A和VEGF-C的mRNA及其蛋白的表達(dá)，以及對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡的作用及機(jī)制。 方法：分別根據(jù)VEGF-A和VEGF-C的cDNA序列合成八對(duì)寡核苷酸片段，退火后分別插入真核表達(dá)載體組成重組質(zhì)粒。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR、測(cè)序鑒定驗(yàn)證后并經(jīng)Western Blot篩選，然后分別

2、將篩選所得的RNA干擾效果最佳的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株IGR-N-91。轉(zhuǎn)染48h后提取總RNA，經(jīng)RT-PCR半定量檢測(cè)VEGF-A和VEGF-C mRNA的表達(dá)水平，Annexin V和PI雙重標(biāo)記流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；PI標(biāo)記后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)IGR-N-91細(xì)胞株細(xì)胞周期的影響；ELISA分別檢測(cè)VEGF-A和VEGF-C蛋白的表達(dá)水平；MTT法檢測(cè)VEGF-A和VEGF-C表達(dá)下降后細(xì)胞增殖的情況。 采用

3、分子克隆的方法，將分別得到驗(yàn)證的VEGF-A和VEGF-C RNA干擾片段切下，構(gòu)建到同一個(gè)真核表達(dá)載體中，得到一個(gè)能夠同時(shí)下調(diào)VEGF-A和VEGF-C表達(dá)的RNA干擾真核表達(dá)載體重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞株IGR-N-91以驗(yàn)證其效果。 結(jié)果：成功構(gòu)建含有VEGF-A和VEGF-C的RNA干擾片段真核表達(dá)載體，經(jīng)Western Blot篩選后分別得到RNA干擾效果最佳的片段。 采用分子克隆的方法，成功將效果最佳

4、的RNA干擾片段插入到同一個(gè)重組質(zhì)粒中并經(jīng)PCR和測(cè)序驗(yàn)證；RT-PCR結(jié)果表明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人神經(jīng)母細(xì)胞瘤后VEGF-A和VEGF-C mRNA受到顯著抑制（p<0.05）；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染的外源基因未引起顯著的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡；ELISA檢測(cè)VEGF-A和VEGF-C蛋白的表達(dá)水平受到顯著抑制；MTT結(jié)果表明腫瘤細(xì)胞的增殖受到顯著抑制；細(xì)胞周期發(fā)生顯著性改變。 結(jié)論：成功構(gòu)建同時(shí)含有人VEGF-A和VEGF-C RN