復(fù)極儲(chǔ)備相關(guān)鉀通道在心力衰竭時(shí)的變化及相互作用研究.pdf

1、背景與目的:心力衰竭（心衰）時(shí)惡性室性心律失常和心源性猝死發(fā)生率增加，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量甚至危及生命。研究顯示心衰時(shí)心律失常發(fā)生率增加與復(fù)極儲(chǔ)備障礙或功能喪失關(guān)系密切，復(fù)極儲(chǔ)備主要依賴(lài)于快速延遲整流鉀電流(IKr)通道和緩慢延遲整流鉀電流(IKs)通道離子流在心肌復(fù)極過(guò)程中相互作用產(chǎn)生的代償性補(bǔ)充，從而緩沖動(dòng)作電位時(shí)程(APD)過(guò)度延長(zhǎng)。本課題一方面利用兔腹主動(dòng)脈縮窄心衰模型，研究心衰時(shí)心室肌細(xì)胞中KCNH2和KCNQ1基因在mRN

2、A水平表達(dá)的變化情況，以及與動(dòng)作電位(AP)、IKr通道和IKs通道離子流之間的關(guān)系，探討心衰時(shí)復(fù)極儲(chǔ)備改變的特征及機(jī)制;另一方面利用轉(zhuǎn)染技術(shù)將KCNH2和KCNQ1基因?qū)爰?xì)胞，研究二者在mRNA、蛋白及離子通道水平的相互影響，進(jìn)一步探討復(fù)極儲(chǔ)備中離子通道間的相互作用機(jī)制。為心衰時(shí)惡性室性心律失常及心源性猝死的機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)與理論依據(jù)。
　　研究方法:24只日本大耳白兔隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham）和心衰模型組(HF)，每組12

3、只，分別行腹主動(dòng)脈分離術(shù)和腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)，術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)12周，評(píng)價(jià)一般情況及心臟超聲指標(biāo)，判定HF組模型建立達(dá)標(biāo)情況。Sham組與HF組動(dòng)物均麻醉取心臟，灌流分離心室肌細(xì)胞，提取總RNA用RT-qPCR方法，比較目的基因KCNH2及KCNQ1的mRNA表達(dá)量在兩組間的差別，應(yīng)用膜片鉗技術(shù)輔以鉀離子通道阻滯劑多非利特(Dof)和293B藥物，檢測(cè)心衰時(shí)心室肌細(xì)胞AP，比較復(fù)極至50％的動(dòng)作電位時(shí)程(APD50)、復(fù)極至90％的動(dòng)作電位時(shí)程

4、(APD90)、動(dòng)作電位幅值(APA)和靜息膜電位（RMP）在各條件下的變化情況，測(cè)定心室肌細(xì)胞IKr電流和IKs電流在不同條件下的改變。另一方面應(yīng)用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)，將HEK293細(xì)胞隨機(jī)分為7組，即單獨(dú)將KCNQ1（Q1組）、野生型WT-KCNH2（WT組）、功能獲得型T618I-KCNH2(T618I組)和功能缺失型V535M-KCNH2（V535M組）與空質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，及將KCNQ1分別與各功能型KCNH2共轉(zhuǎn)染（依次為Q1+WT組、

5、Q1+T618I組和Q1+V535M組）。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，提取細(xì)胞總RNA和總蛋白，分別應(yīng)用RT-qPCR和Western Blot方法檢測(cè)目的基因在mRNA和蛋白水平的相對(duì)表達(dá)量，比較各組間的差別，同時(shí)應(yīng)用膜片鉗技術(shù)檢測(cè)不同功能型KCNH2對(duì)KCNQ1電流的影響。
　　研究結(jié)果:
　　(1)與Sham組相比，HF組兔心室肌細(xì)胞KCNH2基因和KCNQ1基因在mRNA水平表達(dá)均顯著降低(P＜0.05)。
　　(2)

6、與Sham組相比，HF組兔心室肌細(xì)胞AP、APD50和APD90均顯著延長(zhǎng)(P＜0.05)，其中HF組給予Dof干預(yù)后，AP、APD50和APD90均進(jìn)一步延長(zhǎng)(P＜0.05)，若加用293B共同干預(yù)，則AP、APD50和APD90延長(zhǎng)程度與單獨(dú)給予Dof相比增加更顯著(P＜0.05)。
　　(3)兔心室肌細(xì)胞APA和RMP在Sham組、HF組及給予Dof、293B干預(yù)的HF組中無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　(4) HF

7、組兔心室肌細(xì)胞IKr電流密度與Sham組相比顯著降低(P＜0.05)，給予Dof干預(yù)后，兩組IKr電流密度均顯著下降(P＜0.05)，且HF組表現(xiàn)更為明顯。
　　(5) Sham組和HF組中，兔心室肌細(xì)胞IKr尾電流（IKr,tail）均隨刺激脈沖正移不斷增加，但HF組增加幅值低于Sham組。給予Dof干預(yù)后，兩組的IKr,tail均被抑制，隨刺激脈沖電壓增加抑制效應(yīng)增強(qiáng)，且對(duì)HF組作用更明顯。
　　(6) HF組兔心室肌細(xì)

8、胞IKs電流密度與Sham組相比顯著降低(P＜0.05)，給予Dof干預(yù)后IKs電流密度顯著回升(P＜0.05)，但未恢復(fù)至正常水平。
　　(7)不同功能型KCNH2與KCNQ1共轉(zhuǎn)染均可使KCNQ1在mRNA水平的相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P＜0.05)，Q1+V535M組升高最顯著，Q1+WT組次之，Q1+T618I組升高程度最小。共轉(zhuǎn)染KCNQ1可使不同功能型KCNH2在mRNA水平表達(dá)均出現(xiàn)升高，僅野生型升高程度有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

9、＜0.05)。
　　(8)不同功能型KCNH2與KCNQ1共轉(zhuǎn)染均可使KCNQ1在蛋白水平表達(dá)升高(P＜0.05)，其中Q1+T618I組作用最顯著，Q1+WT組作用次之，Q1+V535M組作用最弱。共轉(zhuǎn)染KCNQ1可使不同功能型KCNH2在蛋白水平表達(dá)均升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　(9)野生型WT-KCNH2與KCNQ1共轉(zhuǎn)染能夠使KCNQ1峰電流密度從152.8±7.5 pA/pF增加至209.3±9

10、.1 pA/pF(P＜0.05)，功能獲得型突變T618I-KCNH2與KCNQ1共轉(zhuǎn)染使KCNQ1峰電流密度升高相對(duì)較弱，僅升高至169.2±6.7 pA/pF(P＜0.05)，功能喪失型突變V535M-KCNH2與KCNQ1共轉(zhuǎn)染使KCNQ1峰電流密度升高最為明顯，KCNQ1峰電流密度可升高達(dá)253.5±13.6 pA/pF(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　(1)在mRNA水平，心衰能夠使心室肌細(xì)胞KCNH2和KCNQ

11、1表達(dá)均降低。
　　(2)心衰時(shí)心室肌細(xì)胞APD延長(zhǎng)，IKr和IKs電流密度降低，復(fù)極貯備功能障礙。抑制IKr電流APD延長(zhǎng)增加不大，若同時(shí)抑制IKr和IKs兩種電流，則APD延長(zhǎng)顯著加重。
　　(3) KCNH2與KCNQ1均能使彼此在mRNA水平的表達(dá)升高，且KCNQ1升高程度與KCNH2的功能呈負(fù)相關(guān)。
　　(4)相似地，KCNH2與KCNQ1均能使彼此在蛋白水平的表達(dá)升高，且KCNQ1升高程度與KCNH2的功能