青蒿素對(duì)人宮頸癌細(xì)胞的輻射增敏作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、在眾多的DNA損傷中，最致命的是DNA雙鏈斷裂(DSB)。X射線所導(dǎo)致的DNA雙鏈斷裂將啟動(dòng)細(xì)胞周期關(guān)卡，使細(xì)胞阻滯于G1和G2時(shí)相，同時(shí)對(duì)正處于S期的細(xì)胞，所有的DNA復(fù)制啟動(dòng)與延伸將停止。細(xì)胞受照后發(fā)生細(xì)胞周期阻滯的目的是進(jìn)行損傷修復(fù)。細(xì)胞關(guān)卡是細(xì)胞受到損傷后自我保護(hù)的重要途徑，使細(xì)胞獲得充分的時(shí)間進(jìn)行DNA修復(fù)。p53野生型的腫瘤細(xì)胞可以被阻滯在G1期進(jìn)行損傷修復(fù)，p53突變細(xì)胞在DNA受損后只能被阻滯在G2期以修復(fù)損傷。由于G1

2、期關(guān)卡必須經(jīng)過(guò)p53蛋白才能發(fā)揮作用，因此對(duì)于p53功能缺失的腫瘤細(xì)胞，G2期關(guān)卡就成了受損細(xì)胞在有絲分裂前進(jìn)行DNA修復(fù)的最重要的保護(hù)機(jī)制，G2期阻滯對(duì)這類(lèi)細(xì)胞的存活至關(guān)重要。 目的:檢測(cè)青蒿素對(duì)正常人皮膚成纖維細(xì)胞GM0639、p53野生型人宮頸癌細(xì)胞Siha、p53突變型人宮頸癌細(xì)胞HeLa的毒性作用，確定青蒿素增敏作用的最佳時(shí)間作用點(diǎn)和最佳劑量作用點(diǎn)。研究青蒿素對(duì)GM0639、Siha、HeLa細(xì)胞的輻射增敏作用，探討其

3、輻射增敏作用的機(jī)理。 方法(1)以p53野生型人宮頸癌細(xì)胞Siha、p53突變型人宮頸癌細(xì)胞HeLa兩株細(xì)胞為研究對(duì)象，以正常人皮膚成纖維細(xì)胞GM0639做對(duì)照。用MTT法檢測(cè)經(jīng)濃度為0、27.67、55.34、110.69、221.37、442.75nmol/ml的青蒿素與細(xì)胞作用24、48h的抑制率，分析細(xì)胞抑制率與藥物濃度的關(guān)系；(2)MTT法檢測(cè)55.34、110.69nmol/ml的青蒿素與三株細(xì)胞分別作用0、2、4、

4、6h存活率的變化，檢測(cè)青蒿素與三株細(xì)胞作用0、2、4、6h后4GyX射線對(duì)細(xì)胞存活率的影響；(3)MTT法、克隆形成法檢測(cè)青蒿素對(duì)GM、Siha、HeLa細(xì)胞的輻射增敏作用；(4)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)6GyX射線照射后青蒿素對(duì)GM、Siha、HeLa細(xì)胞的細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡率的改變；(5)WesternBlot法分析周期蛋白CyclinB1和周期蛋白調(diào)節(jié)因子Wee1蛋白的表達(dá)變化。 結(jié)果:(1)GM、Siha、HeLa細(xì)胞的抑

5、制率隨著青蒿素濃度的增加而增大(p<0.01)，隨著與青蒿素作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增大(p<0.01)。(2)55.34、110.69nmol/ml的青蒿素與GM、Siha、HeLa細(xì)胞作用0、2、4、6h后對(duì)細(xì)胞的存活率沒(méi)有影響(p>0.05)。55.34、110.69nmol/ml的青蒿素與GM、Siha細(xì)胞作用0、2、4、6h進(jìn)行X射線照射后的存活率改變不明顯(p>0.05)，110.69nmol/ml的青蒿素與HeLa細(xì)胞作用0、2、

6、4h進(jìn)行X射線照射存活率變化不明顯(p>0.05)，作用6h進(jìn)行X射線照射后存活率明顯降低(p<0.01)。(3)MTT法檢測(cè)110.69nmol/ml的青蒿素與細(xì)胞作用6h對(duì)人正常細(xì)胞GM0639和人宮頸癌細(xì)胞Siha沒(méi)有增敏作用(p>0.05)，對(duì)人宮頸癌細(xì)胞HeLa的增敏作用顯著(p<0.01)，放射增敏比(SER)=1.17；克隆存活實(shí)驗(yàn)檢測(cè)青蒿素對(duì)GM、Siha、HeLa細(xì)胞的輻射增敏性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)青蒿素對(duì)GM、Siha細(xì)胞無(wú)輻

7、射增敏性，對(duì)HeLa細(xì)胞有輻射增敏作用，SER=1.12。(4)青蒿素對(duì)GM、Siha細(xì)胞的細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡率沒(méi)有明顯影響(p>0.05)，青蒿素聯(lián)合X射線組能減弱X射線誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞G2期阻滯；與對(duì)照組和單照組相比，青蒿素聯(lián)合X射線組可以增加HeLa細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率(p<0.01)。(5)青蒿素對(duì)GM、Siha細(xì)胞的周期蛋白CyclinB1、周期蛋白負(fù)性調(diào)節(jié)因子Wee1沒(méi)有影響；青蒿素與HeLa細(xì)胞作用6h組和對(duì)照組Cyclin

8、B1、Wee1蛋白的表達(dá)沒(méi)有發(fā)生變化，6GyX射線照射后CyclinB1蛋白含量降低，Wee1蛋白含量上升，青蒿素聯(lián)合X射線組與單照組相比CyclinB1蛋白含量明顯上升而Wee1蛋白含量明顯下降。 結(jié)論:(1)青蒿素對(duì)GM、Siha、HeLa的抑制率在研究的范圍內(nèi)呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性。(2)青蒿素對(duì)HeLa細(xì)胞有放射增敏作用，而對(duì)GM、Siha細(xì)胞沒(méi)有放射增敏作用。青蒿素對(duì)HeLa細(xì)胞的輻射增敏作用與其降低HeLa細(xì)胞的亞