血清SP-D定量檢測(cè)方法的建立及其作為肺相關(guān)疾病標(biāo)志物的探討.pdf

1、目的:
　　1.采用多肽合成的方式制備SP-D抗原，以及制備SP-D多克隆抗體;
　　2.建立豚鼠HGPRT基因缺陷型瘤細(xì)胞系，并制備豚鼠SP-D單克隆抗體;
　　3.制備診斷用的納米磁微粒;
　　4.建立SP-D納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法(NM-CLIA)為基礎(chǔ)的SP-D定量免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)平臺(tái);
　　5.NM-CLIA定量檢測(cè)人血清SP-D，并初步探討血清SP-D在肺相關(guān)疾病中的臨床意義。
　　方

2、法:
　　1.應(yīng)用DNAStar生物分析軟件，采用Jameson-Wolf法和Emini法對(duì)SP-D蛋白的抗原指數(shù)和蛋白表面可及性進(jìn)行預(yù)測(cè)，多肽合成SP-D抗原，經(jīng)HPLC純化，質(zhì)譜鑒定，并采用重氮法制備SP-D-BSA，以此免疫原制備SP-D多克隆抗體;
　　2.豚鼠轉(zhuǎn)化胚胎細(xì)胞104C1細(xì)胞經(jīng)200rad60Coγ射線輻照誘導(dǎo)，并用8-AG培養(yǎng)篩選出HGPRT基因缺陷型瘤細(xì)胞，以此豚鼠瘤細(xì)胞制備豚鼠SP-D單克隆抗體;<

3、br>　　3.采用共沉淀法制備葡聚糖包覆的納米磁性微粒，經(jīng)表面羧基化處理后得到診斷用的納米磁微粒，并以EDC法制備成納米磁微粒-SA;
　　4.建立血清SP-D納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法，并對(duì)其進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià);
　　5.以建立的NM-CLIA試劑定量測(cè)定健康人、矽塵暴露人群、ILD患者、ALI患者和COPD患者血清中SP-D蛋白水平，并初步評(píng)價(jià)其作為肺相關(guān)疾病診斷生物標(biāo)志物的臨床意義。
　　結(jié)果:
　　1.應(yīng)用

4、DNAStar生物分析軟件預(yù)測(cè)到三個(gè)SP-D線性抗原表位暴露機(jī)率相對(duì)較大氨基酸序列分別為:1(20-35aa)，2(42.71aa)，8(316-332aa)，本次實(shí)驗(yàn)選擇線性抗原表位暴露機(jī)率最大一段多肽:1(20-35aa)，氨基酸序列為:eaemktyshrtmpsac(16aa; MW∶1875Da)HPLC純化后多肽純度為95.5％，經(jīng)質(zhì)譜鑒定偶聯(lián)比為:SP-D∶BSA=4.9∶1;多抗純度＞95％，效價(jià)＞1:106;
　

5、　2.建立了能穩(wěn)定分泌豚鼠SP-D單克隆抗體的5株雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為2B2、3F1、3H4、4C7和5A3，經(jīng)類似物的交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，其中2B2、3F1、4C7和5A3的特異性良好，與SP-D可進(jìn)行特異性結(jié)合，對(duì)SP-A、SP-B、SP-C不發(fā)生交叉反應(yīng)。經(jīng)連續(xù)凍存40次后，3F1分泌抗體的能力最穩(wěn)定;經(jīng)Protein G親和純化系統(tǒng)大量制備SP-D單克隆抗體，純度＞97％，效價(jià)＞1:106，并能識(shí)別特異性的SP-D蛋白的(20

6、-35aa)肽段。
　　3.制備所得納米磁性微粒粒徑約300nm，均一性良好。并以EDC法制備成納米磁微粒-SA，37℃烘箱破壞試驗(yàn)7天后，穩(wěn)定性良好;
　　4.建立了SP-D NM-CLIA定量檢測(cè)方法;該法最低檢測(cè)限為0.22ng/ml，線性范圍1.0-1000.0ng/ml，Hook效應(yīng)在50000ng/ml才出現(xiàn);批內(nèi)與批間變異系數(shù)均＜6.0％;稀釋回收率為91.17％～106.42％，添加回收率為91.00％～10

7、9.63％;與SP-A(10000ng/ml)、SP-B（10000ng/ml）和SP-C（10000ng/ml）交叉反應(yīng)率低于0.1％;0.2mg/ml膽紅素、5mg/ml血紅蛋白、10mg/ml甘油三酯、1500U/ml的類風(fēng)濕因子（RF）、抗凝劑，研究樣本凍融3次和凍存120天對(duì)測(cè)值的無(wú)明顯影響;整個(gè)檢測(cè)所需時(shí)間約22min;
　　5.與正常對(duì)照組（29.33±7.41ng/ml）比較，矽塵暴露組（48.67±17.79ng

8、/ml）、0+組（95.23±24.83 ng/ml）、Ⅰ期矽肺組（160.28±39.05 ng/ml）、間質(zhì)性肺病(ILD)組（85.57±25.12ng/ml）、急性肺損傷(ALI)組（93.64±44.94ng/ml）、慢性阻塞性肺病(COPD)組血清SP-D含量均增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與矽塵暴露組比較， ILD組、ALI組、COPD組、0+組和Ⅰ期矽肺組血清SP-D含量均增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.0

9、1);矽肺Ⅰ期組血清SP-D含量仍然高于0+組、ILD組、ALI組、COPD組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);血清SP-D含量與矽肺病情分級(jí)呈正相關(guān)性(rs=0.764，P＜0.01)。COPD組血清SP-D含量高于ILD組、ALI組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);0+組、ILD組和ALI組三組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.成功制備了SP-D多肽蛋白及其多抗;
　　2.成功建立了豚鼠HGPRT基