七氟醚損傷人紅細胞的體外研究.pdf

1、目的:近年的研究發(fā)現(xiàn),紅細胞數量、大小及功能改變是心血管疾病一個獨立的風險因子。用七氟醚麻醉的患者術后外周血紅細胞數會降低,我們推測是由于七氟醚對紅細胞產生損傷所致。紅細胞損傷后會出現(xiàn)兩種典型病理情況,即衰亡(eryptosis)和壞死(necrosis)。衰亡的紅細胞可被巨噬細胞識別、吞噬,使紅細胞壽命縮短,嚴重時會引起貧血,發(fā)生溶血壞死時釋放的游離血紅蛋白(freehemoglobin,FHB)會清除一氧化氮(NO)使血管系統(tǒng)等功能

2、受損,對組織器官十分有害?，F(xiàn)已證實紅細胞內存在有活性的內皮型一氧化氮合成酶(eNOS),能催化精氨酸與瓜氨酸的轉換,并認為紅細胞內的NO主要依賴eNOS產生。紅細胞的功能和結構的完整性極易受內源性和外源性活性氧含量變化的影響,一直是實驗室用于研究氧化損傷的理想而可靠的模型,我們利用該模型從紅細胞抗氧化能力、紅細胞NO代謝以及紅細胞衰亡三方面考察七氟醚對人紅細胞的影響,并探討其機制。
　　方法:第一部分:不同濃度的七氟醚對人紅細胞溶

3、血率及其抗氧化酶的影響。從健康志愿者全血提純紅細胞,制備成2％紅細胞懸液,使懸液含(mmol/l):氯化鈉145,氯化鉀4,氯化鈣2,葡萄糖5,PH=7.4。紅細胞懸液分成8組(n=4):空氣組(A),1%七氟醚組(S1)、3%七氟醚組(S3)、5%七氟醚組(S5),空氣+H2O2組(A+H組)、1%七氟醚+H2O2組(S1+H組)、3%七氟醚+H2O2組(S3+H組)、5%七氟醚+H2O2組(S5+H組),各組按上述濃度通醚,時間為3

4、0分鐘,孵育15小時后,過氧化氫組加入反應濃度為200umol/L的過氧化氫,對照組加入等體積的林格氏液,各組繼續(xù)孵育3小時。應用酶標分析儀檢測紅細胞溶血率,委托北京華英生物技術研究室檢測紅細胞內過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)的含量。第二部分:不同濃度七氟醚對人紅細胞內NO、NO2-、NO3-、iNOS和eNOS含量變化的影響。實驗組設置及通醚方案同第一部分,委托北京華英生

5、物技術研究室檢測紅細胞內NO、NO2-、NO3-、iNOS及eNOS的含量。第三部分:不同濃度七氟醚對氧化應激誘導人紅細胞衰亡的影響。實驗組設置:前8組設置同第一部分,增加以下8組:空氣+高糖組(A+G組)、1%七氟醚+高糖組(S1+G組)、3%七氟醚+高糖組(S3+G組)、5%七氟醚+高糖組(S5+G組),空氣+CaCl2組(A+C組)、1%七氟醚+CaCl2組(S1+C組)、3%七氟醚+CaCl2組(S3+C組)、5%七氟醚+CaC

6、l2組(S5+C組),各組通醚時間為30分鐘后置于恒溫震蕩培養(yǎng)箱中50rpm,37℃孵育15小時后,分別加入反應濃度為200umol/L的過氧化氫、反應濃度為600mmol/L的葡萄糖溶液、反應濃度為5mmol/L的氯化鈣,繼續(xù)孵育3小時,應用AnnexinV熒光染色檢測各組紅細胞PS標記率及前向散射值(FSC)。
　　結果:第一部分:S3+H組溶血率(17.384±1.976)大于A+H組(10.848±0.274),P=0.0

7、07;S3+H組大于S3組(12.417±0.716),P=0.027。A組過氧化氫酶含量(17.301±4.222)大于S3組(5.431±0.531),P=0.009;A組大于S5組(5.175±0.658),P=0.009;過氧化氫酶含量S1+H組(4.319±0.235)、S3+H組(8.257±1.389)、S5+H組(9.156±0.742)均較A+H組(13.689±2.003)明顯降低(P<0.05)。S1+H組丙二醛含

8、量(3.547±0.898)大于A+H組(2.654±0.509),P-0.031;S3+H組(4.474±0.653)大于A+H組,P=0.021。GSH含量:S3組(6.266±0.254)大于S3+H組(6.097±0.322),P=0.018;A(7.335±0.106)大于S3,P=0.023;GSH-PX各組間均無顯著性差異。第二部分:NO含量:A組(3.199±0.208)小于A+H組(3.622±0.262),P=0.0

9、01;S1組(3.371±0.236)大于S1+H組(2.801±0.12),P=0.003;S3組(2.808±0.244)小于S3+H組(3.372±0.261),P<0.001;S5組(3.172±0.22)大于S5+H組(3.015±0.308),P=0.039;A+H大于SI+H,P=0.002;NO2-含量:A組(16.731±0.434)與A+H組(17.334±0.969),S1組(16.778±0.263)與S1+H組

10、(17.709±1.547),S5組(16.539±0.411)與S5+H組(16.397±0.35),均無顯著性差異,P>0.05;S3組(16.861±0.315)小于S3+H組(17.173±0.294),P=0.016;NO3-含量:A組(49.837±6.09)小于A+H組(65.000±4.173),P=0.002,;S1組(55.128±3.676)小于S1+H組(64.736±2.326),P=0.002;S5組(47.

11、233±4.886)小于S5+H組(57.526±2.148),P=0.005;S3組(55.779±11.342)與S3+H組(58.161±2.36)無顯著性差異,P=0.642;eNOS含量:A組(1.403±0.103)小于A+H組(1.62±0.117),P<0.001;S1組(1.503±0.107)小于S1+H組(1.23±0.075),P=0.002;S3組(1.256±0.112)小于S3+H組(1.508±0.122

12、),P<0.001;S5組(1.414±0.097)小于S5+H組(1.349±0.133),P=0.037;A+H組大于S1+H組,P=0.002;iNOS含量:A組(2.818±0.239)小于A+H組(3.215±0.224),P=0.001;S1組(3.002±0.208)大于S1+H組(2.495±0.106),P=0.003;S3組(2.495±0.209)小于S3+H組(2.984±0.216),P<0.001;S5組(2

13、.818±0.203)大于S5+H組(2.659±0.284),P=0.043;A+H組大于S1+H組,P=0.002.。第三部分:PS標記率:A(1.28±0.62)小于S3(2.803±0.516),A小于S5(3.1775±0.474),S1(1.5925±0.167)小于S3,S1小于S5,P<0.05;A+H(1.47±0.337)小于S3+H(3.1325±0.223),A+H小于S5+H(3.605±0.622),S1+H

14、(2.225±0.357)小于S3+H,S1+H小于S5+H,P<0.05;前向散射值(FSC):A(1239.27±59.701)大于S3(1065.3125±14.607),A組大于S5組(1060.385±26.493),S1(1244.3±88.409)大于S3,S1大于S5,S3大于S5,P<0.05;A+H(1185.868±51.738)大于S5+H(1059.733±12.06),P=0.025。
　　結論:

15、>　　1、七氟醚可使人紅細胞抗氧化能力降低,表現(xiàn)為對活性氧(H2O2)損傷的抵抗能力降低,溶血率增加,MDA含量增高。其機制與抑制紅細胞過氧化氫酶活性、降低GSH含量有關;
　　2、七氟醚抑制人紅細胞NO生成,表現(xiàn)為NO含量下降,降低紅細胞對活性氧(H2O2)應激損傷的耐受性,其機制與抑制紅細胞內eNOS及iNOS活性有關,且iNOS的作用較eNOS顯著;
　　3、紅細胞內存在有活性的eNOS及iNOS,且iNOS含量較高,