華支睪吸蟲CsSP19和CsTSP新基因的發(fā)現(xiàn)及其表達(dá)產(chǎn)物免疫學(xué)功能初步研究.pdf

1、研究目的 利用生物信息學(xué)方法對(duì)新發(fā)現(xiàn)的華支睪吸蟲19kDa分泌蛋白(C．sinensis19kDa secretory protein，CsSP19)和華支睪吸蟲睪丸分泌蛋白(Csinensis testieularsecretory protein，CsTSP)兩個(gè)基因編碼的蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)，并利用基因工程技術(shù)進(jìn)行克隆和表達(dá)，獲得相應(yīng)的重組蛋白，初步研究重組蛋白的免疫學(xué)特性，探討其作為診斷候選抗原分子的潛在價(jià)值。

2、 研究方法 1．華支睪吸蟲成蟲CsSP19和CsTSP的生物信息學(xué)分析從華支睪吸蟲成蟲cDNA質(zhì)粒文庫(kù)的Unigene的全長(zhǎng)基因中篩選出CsSP19和CsTSP，利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)CsSP19和CsTSP的cDNA序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能分析與預(yù)測(cè)，包括核酸水平和氨基酸水平的同源性分析；對(duì)推導(dǎo)的蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)、信號(hào)肽、親水性分析及功能域和二、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析。 2．CsSP19和CsTSP兩基因的克隆、表達(dá)和純化2．1 CsS

3、P19和CsTSP基因的擴(kuò)增、克?。焊鶕?jù)目的基因的ORF設(shè)計(jì)引物，以相應(yīng)的文庫(kù)質(zhì)粒為模板擴(kuò)增出目的片段，用定向克隆方法分別將CsSP19目的片段插入表達(dá)載體pET-28a(+)、將CsTSP目的片段插入pGEX-4T-1中，構(gòu)建的重組質(zhì)粒分別用PCR、雙酶切及測(cè)序進(jìn)行鑒定。 2．2 重組蛋白的表達(dá)和純化：將重組質(zhì)粒pET-28a(+)-CsSP19和pGEX-4T-1-CsTSP分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21，在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)融合蛋白，

4、CsSP19重組包涵體蛋白經(jīng)SDS溶解變性后用His親和層析柱進(jìn)行純化，含GST的CsTSP融合蛋白包涵體通過(guò)切膠、電泳回收進(jìn)行純化。 3．重組蛋白的免疫學(xué)功能研究 3．1 CsSP19重組蛋白的免疫學(xué)功能研究 3．1．1免疫血清的制備： 用純化的CsSP19免疫大鼠，制備大鼠抗CsSP19的免疫血清并進(jìn)行血清預(yù)吸附。 研究結(jié)果 1．CsSP19和CsTSP的生物信息學(xué)分析 1．1

5、 CsSP19基因全長(zhǎng)688bp，最大的開放讀碼框(ORF)含564bp，編碼188aa，起始密碼ATG，終止密碼TAG，理論分子量和等電點(diǎn)分別為21.2kDa和8.02。BLASTX分析CsSP19基因與目前GenBank中已知基因序列的同源性均不高，其中同源性最高為日本血吸蟲一些未知蛋白，一致性為31﹪，相似性47﹪，Score值87，推測(cè)它是華支睪吸蟲功能未知的新基因。保守功能域分析該序列含甾體運(yùn)輸?shù)鞍捉Y(jié)構(gòu)域(sterol car

6、rier protein type,SCP)，SignalP顯示該蛋白含有信號(hào)肽序列，剪切位點(diǎn)在第20-21位氨基酸之間。PredictProtein預(yù)測(cè)CsSP19二級(jí)結(jié)構(gòu)中共有4個(gè)α-螺旋、3個(gè)β-折疊、13個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲，它們?cè)诘鞍字兴嫉谋壤謩e為29.79﹪、11.70﹪、58.51﹪，無(wú)跨膜區(qū)。三級(jí)結(jié)構(gòu)表明蛋白分子呈球狀，62.23﹪的氨基酸殘基暴露于表面，其余位于內(nèi)部；其可能的抗原表位分別位于成熟蛋白的aa61-aa66、a

7、a63-aa69、aa151-aa156。 1．2 CsTSP基因全長(zhǎng)702bp，最大的ORF含450bp，編碼150aa，起始密碼ATG，終止密碼TAA，，理論分子量為16.48kDa，等電點(diǎn)PI為6.39。BLASTX分析與CsTSP同源性最高為日本血吸蟲功能未知蛋白(登錄號(hào)：56752713)，一致性達(dá)50﹪，相似性達(dá)67﹪；CsTSP與多個(gè)物種的附睪分泌蛋白有一定的同源性：其中與熱帶爪蟾同源性達(dá)40﹪；與人的同源性為35

8、﹪。SignalP顯示CsTSP也含有信號(hào)肽序列，剪切位點(diǎn)在第17-18位氨基酸之間；功能域分析CsTSP含有參與脂類的識(shí)別和轉(zhuǎn)運(yùn)的Npc2樣蛋白結(jié)構(gòu)域和與變態(tài)反應(yīng)相關(guān)的Der P 2樣結(jié)構(gòu)域等。CsTSP的二級(jí)結(jié)構(gòu)中有1個(gè)α-螺旋、7個(gè)β-折疊、12個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲，它們?cè)诘鞍字兴嫉谋壤謩e為．10.07﹪、41.61﹪、48.32﹪；CsTSP無(wú)跨膜區(qū)。其可能的抗原表位分別位于成熟蛋白的aa113-aa118、aa115-aa121。

9、 2．CsSP19和CsTSP基因的克隆、表達(dá)和純化 利用兩基因的特異性引物擴(kuò)增出CsSP19和CsTSP目的片段，定向克隆獲得的重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-CsSP19和pGEX-4T-1-CsTSP經(jīng)PCR、雙酶切和測(cè)序證實(shí)構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒在IPTG誘導(dǎo)下以包涵體形式成功表達(dá)出融合蛋白，經(jīng)SDS-PAGE顯示與理論預(yù)測(cè)的融合蛋白分子量相符。SDS-PAGE顯示CsSPl9重組蛋白經(jīng)His親和層析柱純化成功

10、；CsTSP-GKT融合蛋白經(jīng)切膠純化成功。 3．重組蛋白的免疫學(xué)功能研究 3．1 CsSP19重組蛋白的免疫學(xué)功能研究純化的CsSP19蛋白免疫大鼠，獲得了大鼠抗CsSP19免疫血清。Westernblotting證實(shí)CsSP19重組蛋白能被蛋白免疫血清和華支睪吸蟲病人血清識(shí)別，具有免疫原性和抗原性；此外，通過(guò)Western blotting觀察到：CsSP19免疫血清能識(shí)別華支睪吸蟲成蟲分泌排泄抗原中約18.4kDa

11、的組分，與CsSP19去除信號(hào)肽后成熟蛋白理論分子量19kDa大小相接近，從而證實(shí)CsSP19是分泌排泄抗原中的組分。同時(shí)，間接免疫熒光顯示在蟲體組織結(jié)構(gòu)中并未出現(xiàn)特異性熒光，表明CsSP19并非為蟲體結(jié)構(gòu)蛋白，進(jìn)一步提示CsSP19可能為蟲體的分泌/排泄蛋白。 通過(guò)ELISA檢測(cè)33例陽(yáng)性病人血清中不同抗體類型的OD值顯示：IgG<,1>的平均OD值最高(0.834±0.65)，IgG<,2>次之(0.148±0.109)，而

12、IgG<,4>、IgA、IgE的反應(yīng)值極低。以重組CsSP19蛋白作為診斷抗原檢測(cè)病人血清IgG<,1>水平時(shí)，敏感性達(dá)72.22﹪(39/54)，與檢測(cè)血清總IgG的敏感性71.21﹪(47/66)相接近。通過(guò)對(duì)不同感染度病人血清總IgG的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：重組CsSP19用于輕中度感染診斷的敏感性較好，為81.25﹪(39/48)，而檢測(cè)重度和超重度病人敏感性較差。通過(guò)對(duì)非流行區(qū)人群血清和流行區(qū)健康人群血清總IgG的ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，陰性

13、診斷率分別為86.90﹪和97.67﹪，顯示出重組CsSP19用于診斷具有較好的特異性。 3．2 CsTSP-GST融合蛋白的Western blotting鑒定Western blotting顯示CsTSP-GST融合蛋白能被處理組免疫血清和大鼠感染血清所識(shí)別，而對(duì)照免疫血清和陰性大鼠血清不能識(shí)別融合蛋白，可以提示兩點(diǎn)：(1)、切膠得到的用以免疫處理組大鼠的抗原確實(shí)是純化的CsTSP-GST融合蛋白，且其所得的免疫血清中的抗體

14、是針對(duì)融合蛋白線性抗原表位的特異性抗體；(2)、融合蛋白具有免疫原性和抗原性，含有線性抗原表位，可作為免疫診斷的候選抗原。此外，Western blotting顯示融合蛋白免疫血清能識(shí)別單獨(dú)的GST標(biāo)簽蛋白，表明融合蛋白免疫血清中存在針對(duì)GST表位的抗體。 研究結(jié)論 1 CsSP19重組蛋白具有免疫原性和抗原性。 2 CsSP19并非蟲體結(jié)構(gòu)蛋白，可能是蟲體的分泌蛋白，是華支睪吸蟲分泌排泄抗原組分之一。