c-src在原始卵泡啟動中的作用及其機制分析.pdf

1、目的:
　　 探討c-src及其蛋白在原始卵泡當中的表達、分布及其在原始卵泡生長發(fā)育中的作用和機理。
　　 方法:
　　 取2開齡SD雌性大鼠卵巢,在Waymouth培養(yǎng)體系中培養(yǎng)0、4、8天后做石蠟組織HE染色、免疫組化、原位雜交,觀察各級卵泡數(shù)及c-src mRNA和蛋白在其中的表達、分布及含量變化;用腺病毒包裝c-src小干擾片斷轉(zhuǎn)染培養(yǎng)中的卵巢組織進行RNA干擾,或者在培養(yǎng)時加入MAPK抑制劑(PD980

2、59)、PKC抑制劑(Calphostin)、P13K抑制劑(LY294002),用RT-PCR、Western blot等方法檢測RNA干擾及加入各種抑制劑后c-src mRNA和Src蛋白的表達以及p-ERK1/2蛋白、p-PKC蛋白、p-P13K蛋白的表達的情況,用石蠟組織HE染色檢測RNA干擾及加入各種抑制劑后原始卵泡的發(fā)育情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加,原始卵泡在卵泡總數(shù)中所占比例逐漸減少;

3、c-srcmRNA在各組原始卵泡中均有表達,分布由卵母細胞胞漿逐漸擴散到卵母細胞和顆粒細胞的胞漿中:同時,隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加,c-src mRNA表達量增加。Src蛋白在各組原始卵泡中均有表達,分布由卵母細胞和顆粒細胞的胞膜逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槁涯讣毎ぁ㈩w粒細胞胞膜和胞漿中;同時,隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加,Src蛋白表達量增加。
　　 2.DNA測序檢測大鼠卵巢中的c-src mRNA RT-PCR擴增產(chǎn)物序列(250bp),并與GeneBa

4、nk中的序列比較,發(fā)現(xiàn)兩者結(jié)果一致。
　　 3.轉(zhuǎn)染c-src siRNA后,用RT-PCR,western blot方法檢測靶基因c-src表達,發(fā)現(xiàn)RNA干擾后,與空白組、空白載體組相比,最佳干擾組c-src mRNA含量明顯下降,原始卵泡在卵泡總數(shù)中所占比例相對更多,原始卵泡發(fā)育受到抑制:而加入抑制劑各組c-src mRNA含量無明顯變化,但原始卵泡在卵泡總數(shù)中所占比例也相對更多,原始卵泡發(fā)育同樣受到抑制。
　　

5、4.c-src siRNA及加入各種抑制劑后,c-src最佳干擾組Src蛋白含量明顯減少,其余各組無明顯變化;c-src最佳干擾組、PD98059組、Calphostin組和LY294002組p-ERK1/2蛋白含量明顯減少,其余各組無明顯變化:c-src最佳干擾組、Calphostin組、LY294002組PKC蛋白含量明顯減少,而PD98059組無明顯變化:c-src最佳干擾組、LY294002組PI3K蛋白含量明顯減少,其余各組P