轉rolC基因八棱海棠的獲得及其表達研究.pdf

1、八棱海棠(Malus robusta Rchd.)是目前我國使用最廣泛的蘋果喬化砧木，雖具有適應性強、與蘋果品種親和力好等諸多優(yōu)點，但難以適應現(xiàn)代化果樹矮化密植的要求。 rolC基因來源于發(fā)根農桿菌Ri質粒，其表達產物具有水解結合態(tài)細胞分裂素，釋放出自由態(tài)細胞分裂素，從而改變受體植物內源激素平衡的作用。經rolC基因轉化的受體植物，普遍植株矮化的形態(tài)學變化，因此，我們將其轉化進入八棱海棠基因紐，以期獲得矮化的蘋果砧木。

2、本文通過超聲波直接轉導法、超聲波輔助農桿菌介導法將rolC基因轉化進入川麥海棠基因組，并通過PCR、Southern、RT-PCR和Northern等分子檢測技術對利用上述兩種方法以及本試驗室利用農桿菌介導法所獲得的轉rolC基因八棱海棠株系進行了分子鑒定。對rolC基因利用農桿菌介導法所獲得的3個轉基因株系中的表達特征及其表達穩(wěn)定性進行了研究，研究結論如下： 1.應用超聲波輔助農桿菌介導法，對八棱海棠進行，rolC基因轉化。利

3、用gus基因瞬間表達的方法研究了超聲波處理時間、處理時機和農桿菌懸浮液中As濃度對rolC基因轉化率的影響。研究結果表明：葉盤在OD<,600>為0.6且含有75mg.L<'-1>As的農桿菌懸浮液中浸泡2分鐘后，用功率為100w的超聲波處理30秒，再浸泡2分30秒，然后放到的再生培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3天，能獲得最佳的gus基因瞬間表達率。最佳處理條件下轉化683個八棱海棠葉片，共得到138個抗性愈傷組織和15株抗性苗，轉化率為2.2％。GU

4、S染色檢測結果顯示有12個八棱海棠株系的基因組中整合了完整的外源rolC基因。 2.應用超聲波直接轉導法，對八棱海棠進行rolC基因轉化。利用gus基因瞬間表達的方法研究了超聲波處理時間、處理功率和轉化緩沖液中DMS0濃度對rolC基因轉化率的影響。研究結果表明：當DMS0濃度為5％時，用80w功率處理20分鐘，能夠獲得最佳的轉化效果。在超聲波最佳處理條件下轉化486個八棱海棠葉片，共得到237個抗性愈傷組織和9株抗性苗，轉化率

5、為1.85％。GUS染色檢測結果顯示，有8個八棱海棠株系的基因組中整合了完整的外源rolC基因。 3.對分別用農桿菌介導法、超聲波輔助農桿菌介導法和超聲波直接轉導法獲得的具有卡那霉素抗性并呈GUS陽性的轉rolC基因蘋果砧木八棱海棠株系進行分子鑒定和轉錄水平上的表達情況鑒定。其中3個農桿菌介導法獲得的轉基因株系和12個超聲波輔助農桿菌介導法獲得株系PCR檢測全部為陽性，超聲波直接轉導法獲得的9個株系PCR檢測有8個呈陽性。Sou

6、thern雜交結果顯示：3種方法轉化獲得的PCR檢測呈陽性的23個株系均整合了完整的外源rolC基因。其中，2個農桿菌介導法轉基因株系獲得了至少1個拷貝，另外1個獲得了至少2個拷貝；7個超聲波輔助農桿菌轉基因株系獲得了至少1個拷貝，3個獲得了至少2個拷貝，1個獲得了至少3個拷貝，1個獲得了至少4個拷貝；2個超聲波直接轉導法轉基因株系獲得至少2個拷貝，3個株系獲得了至少3個拷貝，2個株系獲得至少4個拷貝，另外1個獲得了至少6個拷貝。RT-

7、PCR檢測表明：農桿菌介導法3個轉基因株系在轉錄水平上均獲得表達；超聲波輔助農桿菌轉化12個轉基因株系中的10個株系獲得表達；而超聲波直接轉導法8個轉基因株系中僅有4個獲得表達。此外，對農桿菌介導法獲得的不同拷貝數(shù)轉基因株系進行Northern雜交表明：單拷貝株系在轉錄水平上的表達豐度高于雙拷貝株系。 4.在含有不同種類和濃度的植物生長調節(jié)劑的培養(yǎng)基上分別研究轉基因植株組培苗莖端增殖、葉片再生、生根等生物學特性；轉基因組培苗生物

8、學特性研究結果表明：(1)3個株系轉rolC基因八棱海棠莖端增殖、葉片再生、生根所需外源激素濃度均顯著低于對照植株，其中單拷貝株系顯著低于雙拷貝株系。(2)3個轉基因八棱海棠株系組培苗生根數(shù)極顯著高于轉基因株系，其中單拷貝株系極顯著高于雙拷貝株系；轉基因株系根長極顯著短于對照植株，其中單拷貝株系極顯著短于雙拷貝株系；轉基因株系和對照植株根粗之間均無顯著差異。 5.以3個不同轉rolC基因八棱海棠株系和對照植株溫室苗的莖尖、葉片和

9、根為試材，用酶聯(lián)免疫吸附法，分別測定其內源細胞分裂素CTKs(iPAs和ZRs)、生長紊(IAA)、赤霉素(GA<,1+3>)、脫落酸(ABA)的含量。結果表明：rolC基因的轉入改變八棱海棠植株中各部位內源激素的含量，但并沒有改變其分布情況。3個株系轉rolC基因八棱海棠植株中內源激素變化趨勢較為一致：各部位的內源細胞分裂素、赤霉紊和脫落酸的含量均比未轉基因對照植株極顯著提高；根部生長素含量極顯著提高，而它在莖尖和葉片中含量均極顯著下

10、降。 6.生根組培苗移栽4個月后，3個轉基因八棱海棠株系株高、節(jié)間長度、節(jié)間數(shù)均極顯著小于對照植株，并且單拷貝株系以上各項指標極顯著小于雙拷貝株系。利用石蠟切片法結合光學顯微鏡，比較它們的莖葉橫切面結構。結果表明：3個轉rolC基因八棱海棠的葉片長度、寬度和葉面積顯著小于未轉基因植株；對照植株葉片下表皮氣孔密度極顯著大于rolC基因單拷貝株系33a和20a，和雙拷貝株系20b相比無顯著差異；轉基因植株和對照植株的氣孔長度和寬度均

11、無顯著差異；對照植株上/下表皮細胞密度則極顯著小于3個轉rolC基因株系；轉基因八棱海棠葉片的柵欄組織和海綿組織的比例是未轉基因植株的1.39-1.48倍；3個轉rolC基因八棱海棠株系的材皮比，導管密度、導管面積以及導管占木質部總面積的比例均顯著低于對照植株。 7.以3個株系的轉rolC基因八棱海棠在無外界抗性壓力篩選情況下無性增殖獲得的第1，2，3代繼代苗以及通過葉片再生獲得的第1，2代再生苗為試材，應用PCR、South

12、ern雜交和RT-PCR研究了外源rolC基因在轉基因八棱海棠無性繁殖過程中的遺傳穩(wěn)定性和轉錄水平上表達的穩(wěn)定性。在此同時，我們對和rolC基因相關的植株生根能力和增殖能力的遺傳特性進行了研究。結果表明：轉rolC基因八棱海棠在無性繁殖過程中外源rolC基因不僅能夠穩(wěn)定的遺傳，而且能夠在轉錄水平上穩(wěn)定表達。無性增殖苗和葉片再生苗的生根能力和增殖能力均能獲得穩(wěn)定的遺傳。 8.分別研究了鹽脅迫和低溫脅迫條件下轉rolC基因八棱海棠葉