HBV基因分型檢測芯片的制備及臨床應(yīng)用.pdf

1、乙型肝炎病毒(HBV)的感染呈世界性分布，在我國尤其多見。HBV感染可導(dǎo)致急、慢性肝炎(CHB)，甚至肝硬化，肝癌。由于病毒變異，HBV基因組分為多個型。根據(jù)其核苷酸序列差異，HBV可劃分為(A-H)8種基因型。目前研究認為，HBV基因型是影響HBV感染者預(yù)后的重要因素之一，因此建立一套快速、準確的HBV分型檢測技術(shù)十分必要。目前診斷HBV基因型的常用方法有DNA測序，聚合酶聯(lián)反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析法(PCR-RFLP)等，在結(jié)

2、果準確性、技術(shù)簡單性方面各有優(yōu)劣，且不能同時檢測所有基因型。近幾年發(fā)展起來的基因芯片技術(shù)彌補上述方法的缺陷。本課題的研究目的在于：建立DNA芯片檢測HBV基因分型的研究方法；并對芯片檢測的特異性、準確性、靈敏度和重復(fù)性進行測試、分析；通過調(diào)查杭州地區(qū)HBV的基因型分布對HBV基因分型檢測芯片在臨床上的應(yīng)用進行初步探索，為病原體基因型檢測芯片這種高科技方法在臨床上的應(yīng)用進行積極探索，積累有益經(jīng)驗。 方法: 1.有關(guān)探針、引

3、物設(shè)計在GenBank數(shù)據(jù)庫中查找HBV各型Pre-S基因組序列，并利用DNAStar軟件進行MegAlign分析，找出其保守序列和特征序列。根據(jù)生物學(xué)軟件Primer primer5.0設(shè)計出不同分型探針及其PCR引物。并對探針進行分析。 2.基因芯片的設(shè)計、制作將設(shè)計好的多條寡核苷酸探針在醛基基片的特定位置上，用點樣儀將探針固定，同一探針平行重復(fù)點樣3次，以觀察其重復(fù)性，為了能在每次實驗時判定實驗操作的正確性，以及是否存在污

4、染，在芯片設(shè)計時增加了如下的質(zhì)控點；標志列、陽性對照行、陰性對照行。 3.雜交、顯色技術(shù)提取血清中DNA，進行PCR擴增后滴于基因芯片上進行雜交，采用酶促顯色技術(shù)檢測雜交結(jié)果。 4.檢測結(jié)果的準確性隨機抽取PCR陽性標本送交上海生工公司進行測序，測序結(jié)果與芯片雜交結(jié)果進行對比，觀察芯片雜交反應(yīng)的準確性。 5.檢測結(jié)果的重復(fù)性分析取20份HBV-DNA陽性標本，每份標本用本法重復(fù)測定3次，觀察結(jié)果是否一致。

5、 結(jié)果: 1.探針、引物設(shè)計在Genbank中查到17個HBV Pre-S基因組序列，共為A、B、C、D、E、F、G7個基因型，對其進行了進化樹分析和多序列比對。根據(jù)序列差異情況和保守序列分布情況設(shè)計出可以擴增出特異序列的PCR引物和7個探針，PCR產(chǎn)物長度為340bp左右。到NCBI上將設(shè)計好的探針進行BLAST，分析評分在前50個的序列及其完全匹配序列，與探針完全匹配的序列基因型一致的為97％。 2.臨床標本檢測用制

6、備的基因芯片檢測HBV各基因型(A-G)標準病毒株DNA樣本，檢測結(jié)果與已知基因型(經(jīng)核酸測序)完全一致；106例HBV-DNA陽性標本均測出其基因型，其中B型37例，占34.91％，C型69例，占65.09％。未發(fā)現(xiàn)其他基因型與混合型感染。 3.DNA序列分析測序結(jié)果與芯片雜交結(jié)果完全一致，進一步證實了檢測結(jié)果的特異性、準確性。經(jīng)過測序分析，雜交特異性和探針匹配程度一致。 4.檢測結(jié)果重復(fù)性測定和靈敏度分析取20份HB

7、V-DNA陽性標本，每份標本用本法重復(fù)測定3次，結(jié)果一致，顯示出良好的重復(fù)性。106例陽性血清，采用熒光定量PCR檢測，HBV-DNA水平最低者為2*104copies/ml，初步認定該芯片的檢測靈敏度不低于此水平。 結(jié)論: 1.通過對HBV基因組的生物信息學(xué)分析，可以設(shè)計出相應(yīng)的探針和引物用于HBV基因分型芯片制作。 2.設(shè)計制備的HBV基因分型芯片能檢測出HBV基因型，初步應(yīng)用于臨床后，顯示出滿意的準確性、特