Notch信號(hào)通路在HBx致L02細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中作用機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的：本研究旨在研究乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）在致人體非腫瘤系肝細(xì)胞L02中的惡性轉(zhuǎn)化作用并初步探討Notch信號(hào)通路在此過程中的作用及機(jī)制。
　　 方法：通過載體將HBx全長(zhǎng)基因轉(zhuǎn)入L02細(xì)胞構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)HBx的細(xì)胞株L02/HBx，觀測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖，細(xì)胞周期及凋亡的變化。再將其接種細(xì)胞于BALB/c裸鼠頸背部皮下，觀測(cè)其成瘤效應(yīng)。進(jìn)一步通過qRT-PCR和Western blotting檢測(cè)HBx對(duì)Notch信號(hào)通路重

2、要分子Jagged1，Notch1，Notch1-IC及Hes1表達(dá)水平的影響。并應(yīng)用γ-分泌酶抑制劑DAPT阻斷Notch信號(hào)通路，通過檢測(cè)阻斷后Notch通路相關(guān)效應(yīng)分子mRNA及蛋白表達(dá)水平的變化來判斷阻斷效率，并觀測(cè)阻斷后細(xì)胞的增殖，細(xì)胞周期及凋亡的變化。
　　 結(jié)果：
　　 （1）與對(duì)照組L02細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染HBx后的L02/HBx細(xì)胞增殖速度顯著加快，凋亡率及G0/G1期細(xì)胞比例明顯降低，S期細(xì)胞比例顯著增高

3、。
　　 （2）裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染HBx后的L02/HBx細(xì)胞腫瘤增長(zhǎng)速度及腫瘤重量顯著高于對(duì)照組。
　　 （3）qRT-PCR及Western blotting檢測(cè)表明，L02/HB x細(xì)胞的Notch1，Jagged1，Notch1-IC，Hes1在mRNA及蛋白表達(dá)水平上均顯著高于L02細(xì)胞。
　　 （4）應(yīng)用γ-分泌酶抑制劑DAPT阻斷Notch信號(hào)通路后，L02/HBx細(xì)胞的存活率呈時(shí)間-劑量依賴性

4、降低，細(xì)胞周期呈時(shí)間-劑量依賴性抑制，凋亡呈時(shí)間-劑量依賴性增加，而阻斷Notch信號(hào)通路對(duì)正常的L02細(xì)胞生物學(xué)行為幾乎沒有影響。
　　 結(jié)論：我們的研究表明，（1）HBx可顯著促進(jìn)人類非腫瘤肝細(xì)胞L02細(xì)胞株在體外和體內(nèi)的生長(zhǎng)，即HBx可誘導(dǎo)L02細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化；（2）在這個(gè)過程中Notch信號(hào)通路的激活是不可缺少的:①在L02細(xì)胞中，HBx基因促進(jìn)Notch信號(hào)通路主要分子Jagged-1,Notch-1,Notch1-

5、IC,Hes-1在mRNA及蛋白水平上的表達(dá)，即在L02細(xì)胞中，異位表達(dá)的HBx可激活Notch信號(hào)通路。結(jié)合第一部分的研究結(jié)果，初步表明Notch信號(hào)通路的激活與HBx刺激L02細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其轉(zhuǎn)化有關(guān)；②通過γ-secretase抑制劑DAPT阻斷L02/HBx細(xì)胞的Notch信號(hào)通路后，HBx所介導(dǎo)的L02細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的生物學(xué)效應(yīng)亦被阻斷，且呈劑量-時(shí)間依賴性；③而DAPT阻斷正常L02細(xì)胞的Notch信號(hào)通路對(duì)其生物學(xué)效應(yīng)幾乎