初級傳入神經(jīng)元TRPM8在大鼠慢性關節(jié)炎性疼痛中的作用.pdf

1、慢性疼痛的治療一直是臨床的難點,冷刺激可以緩解慢性疼痛并可避免常用鎮(zhèn)痛藥物的副作用,但過度的冷刺激卻可誘發(fā)疼痛和冷覺過敏。TRPs通道是位于細胞膜上的一類重要的陽離子通道,在慢性疼痛中發(fā)揮重要作用,是近年研究的熱點。TRPM8是TRPs通道家族的重要成員,主要感知冷刺激,可被包括薄荷醇、icilin等在內(nèi)多種涼性化合物及低溫(<28C)激活。TRPM8的確定為研究冷刺激與疼痛的關系提供了新的途徑和手段。本研究以建立關節(jié)炎大鼠模型為基礎,

2、通過薄荷醇及TRPM8反義寡核苷酸激活或者抑制TRPM8,著重探討TRPM8在慢性炎性疼痛大鼠中的作用。期望這些研究結(jié)果能為日后相關炎性疼痛研究及治療提供依據(jù)。
　　 第一部分:關節(jié)炎大鼠背根神經(jīng)節(jié)TRPM8表達的變化
　　 目的:建立完全弗氏佐劑關節(jié)炎大鼠,觀察其背根神經(jīng)節(jié)TRPM8的表達變化,以探討TRPM8在冷覺過敏形成中的意義。
　　 方法：將30只健康雄性SD大鼠,體重300±20g,隨機分成5組(n=

3、6),制成弗氏佐劑關節(jié)炎模型,分別為關節(jié)炎1天組(CFA-1組)、關節(jié)炎4天組(CFA-4組)、關節(jié)炎7天組(CFA-7組)、關節(jié)炎10天組(CFA-10組)、關節(jié)炎14天組(CFA-14組)；將30只健康雄性SD大鼠隨機分成5組(n=6),制成對照模型,分別為對照1天組(NS-1組)、對照4天組(NS-4組)、對照7天組(NS-7組)、對照10天組(NS-10組)、對照14天組(NS-14組)。動態(tài)監(jiān)測大鼠行為學指標,以免疫組織化學方

4、法檢測大鼠DRG的TRPM8表達。
　　 結(jié)果：模型建立后隨著時間的推移,大鼠右側(cè)L5DRG的TRPM8表達上調(diào),CFA-7組、CFA-10組、CFA-14組三組大鼠TRPM8表達水平達到峰值。對照組DRG的TRPM8表達沒有變化。
　　 結(jié)論：DRG內(nèi)TRPM8可能參與冷覺過敏的形成機制。
　　 第二部分:薄荷醇和TRPM8反義寡核苷酸對慢性關節(jié)炎大鼠痛覺過敏和背根神經(jīng)節(jié)TRPM8表達的影響
　　 目的

5、:建立完全弗氏佐劑關節(jié)炎大鼠模型,觀察薄荷醇、反義寡核苷酸對大鼠行為學的影響以及背根神經(jīng)節(jié)TRPM8的表達變化,以探討TRPM8在慢性炎性痛大鼠中的作用。
　　 方法：健康雄性SD大鼠,體重300±20g,行鞘內(nèi)置管,隨機分成8組(n=8),其中4組制成弗氏佐劑關節(jié)炎模型,鞘內(nèi)分別給予薄荷醇100μg/kg(CFA-Menthol組)、生理鹽水20μl(CFA-NS組)、反義寡核苷酸60μg/kg(CFA-Antisense組)

6、、錯義寡核苷酸60μg/kg(CFA-Missense組)；另外4組制成對照組(假炎癥組),鞘內(nèi)分別給予薄荷醇100μg/kg(NS-Menthol組)、生理鹽水20μl(NS-NS組)、反義寡核苷酸60μg/kg(NS-Antisense組)、錯義寡核苷酸60μg/kg(NS-Missense組)。其中,CFA-Menthol組、CFA-NS組、NS-Menthol組、NS-NS組大鼠致炎后第14天給藥1次；CFA-Antisense

7、組、CFA-Missense組、NS-Antisense組、NS-Missense組致炎后第9天給藥,每天2次,連續(xù)5天。動態(tài)檢測大鼠冷板指標、機械縮爪閾值及熱板縮爪潛伏期。采用免疫組化、westernblot檢測以上各組右側(cè)L5DRG內(nèi)TRPM8的表達。
　　 結(jié)果：CFA-Menthol組大鼠鞘內(nèi)給予薄荷醇后冷覺過敏增強,熱痛敏和機械痛敏有所逆轉(zhuǎn)；CFA-Antisense組大鼠冷覺過敏有所緩解。免疫組化及western結(jié)果

8、顯示,CFA-Menthol組、CFA-NS組以及CFA-Missense組致炎大鼠右L5DRG內(nèi)TRPM8表達上調(diào),鞘內(nèi)給予反義寡核苷酸的CFA-Antisense組、NS-Antisense組大鼠右L5DRG內(nèi)TRPM8表達下調(diào)。
　　 結(jié)論：鞘內(nèi)給予薄荷醇激活表達上調(diào)的TRPM8使致炎大鼠冷覺過敏增強,熱、機械痛敏逆轉(zhuǎn)；鞘內(nèi)給予反義寡核苷酸阻斷TRPM8表達,使致炎大鼠冷覺過敏有所緩解,而對非致炎大鼠的行為學沒有影響。慢性

9、炎性疼痛大鼠的冷覺過敏的變化與TRPM8表達變化有關,薄荷醇的鎮(zhèn)痛作用與TRPM8表達上調(diào)有關。
　　 第三部分:薄荷醇、TRPM8反義寡核苷酸的ED50、ED95的測定
　　 目的:建立完全弗氏佐劑關節(jié)炎大鼠模型,測量大鼠對薄荷醇、反義寡核苷酸反應的ED50、ED95,以探討其在炎性痛大鼠中的量效關系。
　　 方法：健康雄性SD大鼠,體重300±20g,行鞘內(nèi)置管,隨機分為14組(n=10),制成弗氏佐劑關節(jié)炎

10、模型,其中7組第14天鞘內(nèi)分別給予生理鹽水20μl、薄荷醇31.62μg/kg、39.81μg/kg、50.12μg/kg、63.10μg/kg、79.43μg/kg、100.00μg/kg；另7組致炎后第9天鞘內(nèi)分別給予生理鹽水20μl、反義寡核苷酸18.97μg/kg、23.89μg/kg、30.07μg/kg、37.86μg/kg、47.66μg/kg、60.00μg/kg,每天2次,連續(xù)5天；第14天冷板測量大鼠右后足抬足次數(shù),

11、以鹽水對照組抬足次數(shù)為標準,薄荷醇組升高30％記為有效,反義寡核苷酸組降低30％記為有效。按Probit模型分別計算薄荷醇、反義寡核苷酸的ED50及ED95。
　　 結(jié)果：薄荷醇的ED50、ED95分別為:53.36μg/kg、88.31μg/kg；反義寡核苷酸的ED50、ED95分別為:29.92μg/kg、50.36μg/kg。
　　 結(jié)論：薄荷醇的ED50、ED95分別為:53.36μg/kg、88.31μg/kg