白三烯自分泌-旁分泌環(huán)路在大鼠急性肝損傷模型中表達特征及積雪草酸的調控.pdf

1、1白三烯合成酶系在大鼠急性肝損傷模型中表達特征 目的： 探索白三烯合成相關酶系在D－GalN/LPS或CC14誘導的大鼠肝損傷模型中表達和活性變化，為揭示急性肝損傷發(fā)生發(fā)展病理基礎提供相關依據(jù)。 方法： 大鼠經腹腔注射D-GalN/LPS1，3，6，12h誘導肝臟急性損傷模型，并與經D-GalN/LPS所致體外損傷原代培養(yǎng)肝細胞模型比較；或注射CC143，6，12，24h誘導肝臟損傷模型。用酶聯(lián)免疫分析法

2、測定cys-LT量；用HPLC檢測LTC4合成酶系酶活力；RT-PCR測定LTC4S和mGST2mRNA表達；Westernblot檢測LTC4S蛋白表達；免疫組化定位測定LTC4S和mGST2蛋白表達。體外建立肝實質細胞和肝細胞共培養(yǎng)體系，D-GalN/LPS損傷以模擬整體大鼠急性肝損傷模型。 結果： D-GalN/LPS處理6，12h出現(xiàn)顯著的大鼠肝臟損傷，但在處理1，3h時，即伴有cys-LT含量急劇增加，提示cy

3、s-LT聚集極有可能與肝損傷相關。D-GalN/LPS處理1h起，白三烯合成酶系表達呈上調趨勢，伴有酶活力顯著增強。D-GalN/LPS處理原代培養(yǎng)肝細胞中cys-LT含量極低且無顯著變化；LTC4S和mGST2基因表達和酶活力也無顯著變化。原代大鼠肝細胞和枯否細胞共培養(yǎng)體系D-GalN/LPS損傷，結果與整體實驗相吻，提示可較好地模擬整體肝臟損傷模型。 結論： 大鼠D-GalN/LPS急性肝損傷模型中，炎癥因子cys-

4、LT聚集與肝損傷相關；Cys-LT。聚集與白三烯合成酶系的表達上調和酶活力增強相關；大鼠D-GalN/LPS急性肝損傷中cys-LT及其合成酶系表達增加需要肝非實質細胞參與；肝細胞和枯否細胞共培養(yǎng)體系D-GalN/LPS損傷模型，可替代整體模型用于研究LTC4合成酶系在肝臟中作用。 2白三烯受體在大鼠肝組織中定位及在D-GalN/LPS急性肝損傷中表達變化 目的： 探索大鼠肝組織中cysLT1R表達及定位，在D-

5、GalN/LPS急性肝損傷過程中cysLT1R表達變化。 方法： 采用RT-PCR、Westernblot和免疫組化法檢測cysLT1R在大鼠肝臟及肝細胞中表達；采用工具藥觀察肝細胞中表達情況，即用LTD4刺激后，檢測細胞內鈣變化，并觀察特異性受體拮抗劑ONO-1078處理對內鈣變化的影響。構建大鼠D-GalN/LPS急性肝損傷模型，檢測cysLT1R的表達變化。 結果： RT-PCR和Westernbl

6、ot檢測均表明大鼠肝臟及肝細胞中有mRNA和蛋白表達；免疫組化法檢測表明cysLT1R分布于內皮細胞和肝細胞的細胞膜上。采用工具藥觀察結果也表明肝細胞中存在cysLT1R表達。大鼠D－GalN/LPS處理6、12h后肝臟cysLT1R表達增加。 結論： 大鼠肝臟內皮細胞及肝細胞中表達cysLT1R，且在D-GalN/LPS處理后期存在表達增加。 3積雪草酸對大鼠原代肝細胞共培養(yǎng)體系損傷保護作用及對白三烯環(huán)路相關的

7、調控機制研究 目的： 探索Redox信號通路對大鼠原代肝細胞和枯否細胞共培養(yǎng)體系D-GalN/LPS損傷中LTC4S表達的調控，研究AA對其保護作用及其保護機制是否與影響該通路相關。 方法： 檢測共培養(yǎng)體系中redox相關因子ROS和GSH量，及redox下游信號ERK和NF-κB信號分子的時效變化，并通過信號通路特異性抑制劑U0126或redox抑制劑PDTC研究，對共培養(yǎng)體系LTC4S的調控進行研究。

8、以細胞活力、細胞增殖、細胞形態(tài)和AST、LDH為指標觀察肝細胞和枯否細胞共培養(yǎng)體系D-GalN/LPS損傷的保護作用。JC-1染色法測定線粒體膜電位，AO-EB觀察細胞損傷情況，DNA片斷化檢測細胞有無片段化，熒光探針法檢測共培養(yǎng)體系中ROS和GSH含量。Westernblot方法分析此模型中自三烯合成相關蛋白5-LO、FLAP、LTC4S和cysLT1R表達變化。1，3，10μmol/LAA預處理共培養(yǎng)體系后，再對以上指標進行檢測。

9、 結果： 共培養(yǎng)體系D-GalN/LPS損傷后，呈現(xiàn)ROS生成增加和ERK、NF-κB激活。特異性抑制劑預處理后，ERK和ROS激活受抑制并伴有一定程度逆轉LTC4S表達上調；且對共培養(yǎng)體系D-GalN/LPS所致?lián)p傷有一定保護作用。細胞活力、細胞增殖、細胞形態(tài)和AST、LDH等指標均表明AA對肝細胞和枯否細胞共培養(yǎng)體系D-GalN/LPS損傷有保護作用。JC-1染色結果、AO-EB和DNA片斷化檢測結果表明D-GalN/

10、LPS處理后出現(xiàn)凋亡，AA預處理能部分抑制細胞凋亡。共培養(yǎng)體系D-GalN/LPS損傷后ROS生成增加、GSH含量降低和GSH/GSSG比值降低，表明體系內氧化還原態(tài)損傷；AA預處理部分逆轉氧化還原態(tài)失衡。AA預處理抑制共培養(yǎng)體系D-GalN/LPs損傷所致5-LO、FLAP、LTC4S和cysLT1R表達上調和cys-LT增加。 結論： D-GalN/LPS損傷肝細胞和枯否細胞共培養(yǎng)體系中LTC4S表達受redox信號