癌胚抗原及癌抗原15-3電化學(xué)免疫傳感器的研究.pdf

1、癌胚抗原(CEA)和癌抗原15-3(CA 15-3)是國(guó)際公認(rèn)的腫瘤標(biāo)志物，目前被普遍應(yīng)用于惡性腫瘤的輔助診斷、療效評(píng)價(jià)和檢測(cè)復(fù)發(fā)，如果血液中CEA或CA 15-3呈現(xiàn)較高濃度時(shí)，往往與肺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肝硬化及肝炎等疾病有很大的關(guān)系，因此，快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)血清中CEA或CA 15-3的含量具有非常重要的臨床價(jià)值。目前檢測(cè)方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)、放射性免疫法(RIA)和化學(xué)發(fā)光免疫法(CLIA)等，但這

2、些方法操作復(fù)雜、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、有放射性污染等缺點(diǎn)。電化學(xué)免疫傳感器在臨床醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品和發(fā)酵工業(yè)以及農(nóng)業(yè)和國(guó)防等方面都有重要應(yīng)用，并以其制備簡(jiǎn)單、靈敏度高、價(jià)格低廉、檢測(cè)快速方便和容易實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)在線活體檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者采用不同的固定方法將抗體固定在傳感器上來(lái)檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物，并取得了較好的進(jìn)展，但其檢測(cè)方法和靈敏度仍不能滿足實(shí)際的需要，因此，開發(fā)高靈敏、簡(jiǎn)便、快速的檢測(cè)方法對(duì)免疫傳感器中抗原或抗

3、體的檢測(cè)具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。 在電化學(xué)免疫傳感器的構(gòu)建中，如何有效地利用生物分子固定化技術(shù)及固定化材料決定著生物傳感器的穩(wěn)定性、靈敏度和選擇性等主要性能。本文運(yùn)用電沉積、靜電吸附、共價(jià)鍵合等技術(shù)，利用具有強(qiáng)吸附作用的納米顆粒(納米金)和納米復(fù)合材料(DNA/納米銀復(fù)合物)將不同的抗體固定在電極表面，實(shí)現(xiàn)抗原-抗體實(shí)時(shí)、在線檢測(cè)；同時(shí)利用生物相容性良好的雙鏈DNA(dsDNA)分子擴(kuò)大電極的表面積，增加抗體的固定量，

4、解決了傳統(tǒng)免疫傳感器靈敏度低、壽命短的缺點(diǎn)。 本論文主要從以下幾方面開展研究工作： 1.利用納米金和(3-巰基丙基)-三甲氧基硅烷(MPTS)作為雙重放大基質(zhì)，研制成一種高靈敏電位型癌胚抗原(CEA)免疫傳感器。MPTS通過(guò)-SH固定在金電極表面，并通過(guò)三個(gè)-OCH3為后續(xù)分子的固定提供更多的鍵合位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)第一重放大。納米金通過(guò)其大的比表面積和良好的生物相容性吸附更多抗體實(shí)現(xiàn)第二重放大。比較研究了戊二醛(GA)和MPTS共

5、修飾的免疫傳感器、納米金和巰基乙胺(AET)共修飾的免疫傳感器、納米金和MPTS共修飾的免疫傳感器的電位響應(yīng)，證實(shí)了納米金和MPTS的雙重放大作用。另外研究了電極修飾過(guò)程中MPTS和羥胺(NH)的反應(yīng)時(shí)間、抗原和抗體的孵育時(shí)間、孵育溫度等實(shí)驗(yàn)條件和參數(shù)對(duì)傳感器性能的影響。在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，該免疫傳感器的線性范圍是4.4～85.7 ng/mL-1，檢出限為1.2ng/mL-1。 2.將硫堇聚合到玻碳電極(GCE)表面形成帶正電的多孔聚硫堇

6、(PTH)復(fù)合膜，通過(guò)靜電吸附固定DNA/納米銀復(fù)合物，利用復(fù)合物中納米銀大的比表面積和強(qiáng)的吸附能力將癌胚抗體(anti-CEA)固定到電極表面，從而制得高靈敏的電流型癌胚抗原(CEA)免疫傳感器。通過(guò)循環(huán)伏安法考察了電極表面的電化學(xué)行為，并對(duì)免疫傳感器的性能進(jìn)行了詳細(xì)研究。在最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下，用示差脈沖伏安法(DPV)對(duì)癌胚抗原進(jìn)行檢測(cè)，其線性范圍為1.O～10.0 ng/mL-1和10.0～80.0 ng/mL-1，線性相關(guān)系數(shù)分別

7、為0.9983和0.9970，檢測(cè)限為0.24 ng-mL-1，并將該免疫傳感器用于血清樣品中CEA的檢測(cè)。 3.利用電化學(xué)還原氯金酸(HAuCl4)的方法將第一層納米金固定在普魯士藍(lán)(PB)修飾的金電極(Au)表面，再通過(guò)共價(jià)鍵合固定雙鏈DNA(dsDNA)，最后電化學(xué)還原氯金酸將第二層納米金固定在雙鏈DNA的表面，利用納米金大的比表面積和強(qiáng)的吸附能力將癌抗原15-3抗體(anti-CA 15-3)固定到電極表面，從而制得高靈

8、敏的電流型癌抗原15-3(CA 15-3)免疫傳感器。通過(guò)掃描電子顯微鏡(SEM)和循環(huán)伏安法(CV)考察了電極的修飾過(guò)程，并對(duì)免疫傳感器的性能和影響因素進(jìn)行了詳細(xì)研究。在最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下，用循環(huán)伏安法對(duì)癌抗原15-3進(jìn)行檢測(cè)，其線性范圍為1.0～15.0 ng/mL-1和15.0～240.0 ng/mL-1，檢測(cè)限為0.6ng/mL-1。該免疫傳感器呈現(xiàn)較高的靈敏度、良好的選擇性和較強(qiáng)的穩(wěn)定性，并將該免疫傳感器用于血清樣品中CA 15