β-欖香烯對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡、成血管能力及MMP-2、MMP-9活性的影響.pdf

1、腫瘤在其發(fā)生發(fā)展過程中可分為兩個階段，當(dāng)腫瘤體積小于1mm3時(shí)，主要依靠滲透獲得營養(yǎng)，即血管前期（prevascular phase），為無血管生長期；當(dāng)腫瘤體積大于1mm3時(shí)，主要依靠血管生成獲得營養(yǎng)，即血管期（vascular phase）。
　　 從血管形成的觀點(diǎn)來說，進(jìn)展期的腫瘤應(yīng)該被看作一個發(fā)育中的器官，血管形成在其過程中的作用和器官發(fā)生時(shí)同樣重要。如果沒有充足的血供，缺少生長所需的氧和其他營養(yǎng)成分，腫瘤很難長大超過2

2、-3mm3。因此，抗血管生成在腫瘤的治療中顯得尤為重要。
　　 在血管生成過程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖取決于腫瘤微環(huán)境內(nèi)促進(jìn)增殖和誘導(dǎo)凋亡二者信號強(qiáng)度的對比。所以，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長和誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡能夠抑制腫瘤的血管生成。
　　 基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）是高度保守的依賴于鋅離子的內(nèi)切蛋白水解酶家族，能夠選擇性消化廣泛的細(xì)胞外基質(zhì)和非基質(zhì)蛋白，Ⅳ型膠原是細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的主要結(jié)構(gòu)蛋白，Ⅳ型膠原酶MMP-2，MMP

3、-9是降解Ⅳ型膠原最主要的酶，在內(nèi)皮血管生成的早期血管基底膜的降解中起重要作用。因此抑制MMP-2和MMP-9的活性可以有效防止血管基底膜的降解，減少腫瘤的血管形成。
　　 欖香烯（elemene）是我國自行開發(fā)研制的非細(xì)胞毒性抗腫瘤藥物。它是從姜科植物溫郁金（莪術(shù)）中提取的以β-欖香烯（化學(xué)名：1-甲基-1-乙烯基-2，4-二異丙基環(huán)己烷）為主要成分的欖香烯類化合物。大量研究表明，欖香烯能有效抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長增殖。抑制腫

4、瘤細(xì)胞核酸合成，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和分化是其作用機(jī)制的一個主要特點(diǎn)；欖香烯能增強(qiáng)腫瘤的免疫原性，改善和提高荷瘤機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。此外，欖香烯還具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移、毒副作用小和不易耐藥等優(yōu)點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。然而，目前關(guān)于β-欖香烯抗腫瘤血管生成的研究較少。
　　 一、細(xì)胞培養(yǎng)
　　 將ECV-304細(xì)胞置于含10％FBS的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃，5％CO2培養(yǎng)箱（FORMA）中培養(yǎng)，用0.125％胰酶（含0.02％E

5、DTA）消化，傳代。在細(xì)胞培養(yǎng)及β-欖香烯干預(yù)后，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。
　　 二、Matrigel膠檢測ECV-304細(xì)胞的成血管能力
　　 將ECV-304細(xì)胞接種于24孔板，每孔約1×106個，培養(yǎng)24小時(shí)；棄上清液，分別加入含有20μg/ml，40μg/ml，80μ/ml，160μg/mlβ-欖香烯的培養(yǎng)液，以不含β-欖香烯的孔為對照組，每濃度平行4孔，繼續(xù)培養(yǎng)24，48，72小時(shí)。將細(xì)胞用胰酶消化吹打

6、，制成細(xì)胞懸液。將Matrigel膠涂于另一24孔板，每孔30-40μl，涂勻后孵箱內(nèi)靜置30分鐘，待膠凝固，將細(xì)胞懸液接種于涂有Matrigel膠的24孔板內(nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。在倒置顯微鏡下觀察管腔形成情況，每孔隨機(jī)選取5個視野計(jì)數(shù)管腔數(shù)，并取平均值。
　　 三、四唑氮藍(lán)還原反應(yīng)（MTT）檢測細(xì)胞增殖
　　 將ECV-304細(xì)胞以每孔200μl細(xì)胞懸液（細(xì)胞濃度為1×104/ml）接種于96孔板中，培養(yǎng)24小時(shí)，吸出

7、培養(yǎng)液；加入無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)，使細(xì)胞生長同步化；再次吸出培養(yǎng)液，分別加入含有20μg/ml，40μg/ml，80μg/ml，160μg/mlβ-欖香烯的培養(yǎng)液，以不含β-欖香烯的孔為對照組，每濃度平行6孔，繼續(xù)培養(yǎng)24，48，72小時(shí)。吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μl，4小時(shí)后孔內(nèi)形成紫色結(jié)晶，每孔加入200μl DMSO溶液終止反應(yīng)，振蕩混勻，使結(jié)晶充分溶解，置于酶標(biāo)儀上檢測光吸收值（OD），測定波

8、長為490nm。
　　 四、碘化丙啶（PI）標(biāo)記流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期
　　 將ECV-304細(xì)胞接種于24孔板，每孔1×106個，培養(yǎng)24小時(shí)；棄上清液，分別加入含有20μg/ml，40μg/ml，80μg/ml，160μg/mlβ-欖香烯的培養(yǎng)液，以不含β-欖香烯的孔為對照組，每濃度平行4孔，繼續(xù)培養(yǎng)24，48，72小時(shí)。將細(xì)胞用胰酶消化吹打，制成細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至離心管中，1500轉(zhuǎn)/min，離心10分鐘，PBS清洗

9、2次。棄上清，用4℃預(yù)冷的75％乙醇固定，4℃過夜。1500轉(zhuǎn)/min，離心10分鐘，PBS清洗1次，棄上清，加入終濃度為200μg/ml的RNase A，37℃孵育1小時(shí)；再加入濃度為20μg/ml的PI溶液，4℃避光染色30分鐘。流式細(xì)胞儀上進(jìn)行DNA含量和細(xì)胞周期分析得出細(xì)胞各周期的百分率。
　　 五、Annexin-V/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡
　　 細(xì)胞接種、干預(yù)和培養(yǎng)方法見上。β-欖香烯作用細(xì)胞24，4

10、8，72h后，棄去上液，用PBS沖洗1次。加入0.25％胰酶消化，1500r/min離心10min，收集細(xì)胞。用預(yù)冷的PBS洗2次。用250μl結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞數(shù)目為1×106。取195μl細(xì)胞懸液，先加入5μlAnnexin-V/FITC，室溫避光染色30分鐘后，加入10μl碘化丙錠（PI）溶液，混勻后室溫避光孵育30min。在反應(yīng)管中加入400μl結(jié)合緩沖液，在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析。
　　 六、明膠酶譜實(shí)驗(yàn)

11、測定ECV-304細(xì)胞中MMP-2，MMP-9的活性
　　 取對數(shù)生長期細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/ml，接種于24孔板，培養(yǎng)24h后離心去上清，加入不同濃度β-欖香烯孵育24，48，72h后收取上清，再按5:1與上樣緩沖液混合，上樣于含0.8g/L聚丙烯酰胺凝膠中。作SDS-PAGE，初始電壓為80V電泳30min，待溴酚藍(lán)達(dá)分離膠后加至150V電泳70-80min。電泳所得凝膠依次洗脫（40分鐘，兩次），

12、漂洗（20分鐘，兩次），孵育（37℃，48小時(shí)），用考馬斯亮藍(lán)染色4h，再脫色。凝膠圖像掃描入計(jì)算機(jī)后即可對其條帶進(jìn)行半定量分析。
　　 七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 一、β-欖香烯對ECV-304細(xì)胞成血管能力的影響
　　 除20μg/mlβ-欖香烯作用于ECV-304細(xì)胞24小時(shí)，管

13、腔形成數(shù)目與對照組相比無明顯差異外，其余濃度β-欖香烯作用于內(nèi)皮細(xì)胞24，48，72小時(shí)，均可明顯減少ECV-304細(xì)胞形成管腔的數(shù)目，并呈劑量和時(shí)間依賴性。
　　 二、β-欖香烯對ECV-304細(xì)胞增殖的抑制作用
　　 MTT法檢測，除20μg/mlβ-欖香烯作用24小時(shí)，對ECV-304細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用外，其余濃度β-欖香烯作用24，48，72小時(shí)對ECV-304細(xì)胞的增殖均有明顯的抑制作用，并呈劑量和時(shí)間依賴

14、性。
　　 三、β-欖香烯對ECV-304細(xì)胞周期的影響
　　 經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，除20μg/mlβ-欖香烯作用于ECV-304細(xì)胞24小時(shí)后，G1期細(xì)胞百分比較對照組減少，其余濃度β-欖香烯作用于內(nèi)皮細(xì)胞24，48，72小時(shí)后，G1期細(xì)胞明顯增多，而G2期和S期細(xì)胞減少，出現(xiàn)了G1期阻滯，并呈劑量和時(shí)間依賴性。
　　 四、β-欖香烯對ECV-304細(xì)胞凋亡的影響
　　 經(jīng)Annexin V/PI雙染流式

15、細(xì)胞儀檢測，濃度為40μg/ml，80μg/ml，160μg/ml的β-欖香烯作用于ECV-304細(xì)胞24，48，72小時(shí)后，細(xì)胞凋亡百分比明顯增高，呈劑量和時(shí)間依賴性。
　　 五、β-欖香烯對ECV-304細(xì)胞中MMP-2，MMP-9活性的影響
　　 明膠酶譜實(shí)驗(yàn)顯示，β-欖香烯濃度為80μg/ml及160μg/ml作用于ECV-304細(xì)胞24，48，72小時(shí)后，MMP-2和MMP-9的活性較對照組減弱，而濃度為20μ

16、g/ml及40μg/ml的β-欖香烯作用24小時(shí)，MMP-2和MMP-9的活性與對照組相比并無明顯差異。
　　 結(jié)論：
　　 1、β-欖香烯可以抑制體外培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的成血管能力，使血管內(nèi)皮細(xì)胞在Matrigel膠中形成的管腔數(shù)目減少。
　　 2、β-欖香烯可抑制體外培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，使血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生G1期阻滯，并且凋亡增多。
　　 3、β-欖香烯能夠抑制體外培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP