新型PLA-BMG多孔復合生物活性材料的制備及相關研究.pdf

1、本文主要就新型PLA/BMG多孔復合生物活性材料的制備及相關進行了研究，全文分以幾部分： 第一章 PLA/BMG多孔復合生物活性材料的制備及理化性質檢測 目的：制備骨基質明膠(BMG)，采用超臨界二氧化碳法與聚乳酸(PLA)復合制備PLA/BMG多孔復合生物活性骨植入材料，通過理化性能檢測選擇 PLA/BMG最佳復合比例，為后續(xù)實驗研究提供依據(jù)。 方法：選取合格供體皮質骨，按山西省醫(yī)用組織庫同種骨生產(chǎn)標準進行冷凍

2、、清洗，粉碎后選擇粒徑大小為50 μm～200 gm的骨粉，將其進行脫脂、脫鈣等處理制備成骨基質明膠(BMG)；將PLA與BMG按體積比10：0、9：1、8：2，7：3，6：4進行混勻，再加入粒徑為100 μm～200 μm的NaCl顆粒作為造孔劑(與復合材料的質量比為3：1)，置于超臨界二氧化碳反應裝置內，將其密封后用液泵將冷凝到0℃以下的CO<,2>壓進反應釜內，當反應釜內壓力達到20 MPa時，開始升溫，使反應釜內溫度達到36℃，

3、調節(jié)釜內的壓力和溫度，保持溫度變化不超過士0.5℃，壓力變化為±0.1 MPa。經(jīng)過30 min后，以5 MPa/min的速率放氣，打開反應釜，取出樣品，去離子水浸瀝NaCl 48 h，冷凍干燥，包裝后進行輻照滅菌備用。通過大體觀察、孔隙率測定，力學檢測、SEM觀察評價其理化性能，并結合體外細胞相容性檢測選擇最佳復合比例。 結論：采用SC-CO<,2>法制備的PLA/BMG多孔復合支架材料中BMG的比例與材料的孔隙率及細胞相容性

4、成正相關，與力學性能成負相關；含30％BMG的復合材料具有良好的綜合性能，為SC-CO<,2>法制備PLA/BMG的最佳復合比例。 第二章 PLA/BMG多孔復合材料生物相容性檢測 目的：采用動物體內實驗和細胞體外實驗評價所制備PLA/BMG多孔復合生物活性材料的組織生相容及細胞相容性，為PLA/BMG復合材料提供生物相容性實驗數(shù)據(jù)。 方法：體外細胞毒性評價：參照中華人民共和國醫(yī)療器械生物學評價標準，將所制備的P

5、LA/BMG復合材料、PLA材料按質量與浸提液0.1 g/ml的比例，浸入不含血清的DMEM高糖培養(yǎng)基的封閉容器內，37℃培養(yǎng)箱72 h，取出材料，將浸提液離心，取上清液并加入10％的胎牛血清；將對數(shù)生長期的小鼠MC3T3-E1成骨前體細胞制備為1.5×10<'5>/ml細胞懸液，并接種于96孔培養(yǎng)板，單純DMEM高糖培養(yǎng)液組作陰性對照，不含細胞孔作為空白對照，每孔200 μl，培養(yǎng)24 h待細胞貼壁后，按組別分別加入200 μl材料浸

6、提液，置37℃5％CO<,2>培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d更換浸提液一次。分別于培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7d后，每孔加入30 μl 2 mg/ml的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸出孔內培養(yǎng)液后，每孔加入150 μl DMSO，振蕩使結晶物溶解，酶標儀檢測各孔OD值，測試波長為570 nm，計算細胞增殖率并轉換為細胞毒性級。PLA/BMG復合材料細胞親和性測定：將PLA/BMG修剪成3 mm×3 mm×3 mm大小，放置于6孔培養(yǎng)板；傳

7、代至第3代的MC3T3-E1細胞以1×10<'4>/ml接種于已放置材料的培養(yǎng)板，加DMEM高糖培養(yǎng)基至完全淹沒材料，于接種后1、3、5天倒置相差顯微鏡觀察細胞生長及與材料貼附情況，并于第5天取出材料，掃描電鏡觀察細胞貼附情況。生物相容性體內評價：Wistar大鼠20只，無菌條件下，分別將PLA及PLA/BMG植于脊柱左、右側的皮下，及左右后肢的股肌袋內，術后行大體觀察術后飲食、活動、切口反應等，于術后2、4、6、8周隨機處死5只動物，

8、切取包括植入材料及周圍組織的復合組織塊，常規(guī)組織切片，HE染色，光鏡下觀察材料及周圍組織的組織學變化。 結論：SC-CO<,2>法制備的PLA/BMG復合材料對MC3T3-E1細胞有較好的細胞親和性，細胞毒性級別為0級，具有良好的細胞相容性；皮下及肌內植入均顯示PLA/BMG復合材料較單純PLA材料具有更好的組織相容性。 第三章PLA/BMG多孔復合材料生物活性檢測 目的：體外將PLA/BMG復合材料與小鼠MC3

9、T3-E1成骨前體細胞共培養(yǎng)，通過對鈣結節(jié)、鈣含量與ALP活性的測定，間接評價PLA/BMG多孔復合材料的骨誘導活性，為進一步實驗提供實驗依據(jù)。 方法：實驗分組：DMEM組為培養(yǎng)基對照組(不含任何材料)；PLA/BMG組為每孔加入100 μg粉碎的PLA/BMG復合材料；PLA組為每孔加入100μg粉碎的PLA；每組設6復孔。將小鼠MC3T3-E1成骨前體細胞適當傳代后，稀釋制成2×10<'6>/ml細胞懸浮液，每孔20μl接種

10、于含不同組別材料的24孔培養(yǎng)板內，細胞粘壁后，分別加入1 ml含10 μmol/ml β-甘油磷酸及5 μg/ml抗壞血酸的DMEM高糖培養(yǎng)基。每3 d換液一次，每次換液量為培養(yǎng)液的2/3，培養(yǎng)2周后，消化收集細胞。鈣結節(jié)測定：PBS沖洗收集細胞后的培養(yǎng)板，福爾馬林溶液固定后，1％茜素紅溶液染色，倒置相差顯微鏡觀察，數(shù)碼相機拍攝每個培養(yǎng)孔圖像，圖像處理與分析軟件測定被染色面積占培養(yǎng)孔總面積的百分比，即為鈣化結節(jié)面積百分比。鈣含量及堿性磷

11、酸酶(ALP)活性測定：0.2％的NP-40重新懸浮收集細胞，在冰浴中超聲裂解，將細胞裂解液嚴格按照鈣含量及ALP活性測定試劑盒說明書進行鈣含量及ALP活性的檢測。應用方差分析和 Tamhane's T2檢驗進行統(tǒng)計學分析。 結論：采用SC-CO<,2>法制備的PLA/BMG多孔復合支架材料具有良好的骨誘導活性，好于單純PLA材料，有可能作為一種有前景的骨植入材料及骨組織工程支架材料。 第四章 PLA/BMG多孔復合材料

12、修復兔橈骨節(jié)段性骨缺損的實驗研究 目的：建立兔橈骨節(jié)段性骨缺損模型并將PLA/BMG多孔復合材料植入，評價其修復節(jié)段性骨缺損的能力，為可能的臨床應用提供實驗依據(jù)。 方法：選用新西蘭大白兔24只，腹腔麻醉后，無菌操作暴露橈骨中段，牙科鉆截取兔雙側橈骨中段，造成約12 mm骨缺損，按組別分別植入各組材料，于術后4 w、8 w、12 w分別取材，每次8只。實驗分組：空白對照組，骨缺損處不植入任何材料作為陰性對照；PLA材料組，

13、骨缺損處植入PLA材料；PLA/BMG復合材料組，骨缺損處植入PLA/BMG多孔復合材料；自體骨組，骨缺損處將截取的自體骨再植入骨缺損處，作為陽性對照。X光檢查：動物于取材時間，行橈骨正位X線片檢查，觀察不同時間點骨缺損愈合情況。根據(jù)Lane等的X線片評分標準對各組移植區(qū)骨形成、骨連接和骨塑形情況進行評分，并進行統(tǒng)計學檢驗。組織學觀察：截取橈骨植骨部位，有機樹脂包埋，用硬組織切片機制作厚度為5 μm切片標本，進行HE染色，光鏡下觀察骨形