沼氣發(fā)酵過程中產甲烷菌分子多樣性研究及產甲烷菌的分離.pdf

1、沼氣發(fā)酵過程是一個由多種微生物聯(lián)合，交替作用的復雜生化過程。在發(fā)酵過程中，不產甲烷細菌和產甲烷菌之間，相互依賴，又互相制約，在發(fā)酵過程中處于平衡狀態(tài)。而在發(fā)酵過程中微生物的代謝活動與相互作用也體現(xiàn)在發(fā)酵反應中物料的理化性質的改變上。 在沼氣發(fā)酵中，產甲烷菌是沼氣發(fā)酵微生物的核心，作為自然界碳素循環(huán)中厭氧生物鏈的最后一個成員，分析沼氣發(fā)酵過程中產甲烷菌的變化，對于了解發(fā)酵程度，優(yōu)化發(fā)酵條件，提高沼氣產量，具有十分重要的意義。目前已

2、知，自然環(huán)境中的微生物有90-99％是還未可培養(yǎng)的，加之產甲烷菌的嚴格厭氧性、培養(yǎng)周期長等特點，使得通過傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離技術對產甲烷菌群落結構的分析十分困難，隨著現(xiàn)代分子生物學的發(fā)展，特別是16SrDNA分析的方法引入?yún)捬醐h(huán)境微生物群落的研究中，使得快速、全面、準確地研究厭氧系統(tǒng)內的產甲烷菌的群落結構的多樣性成為可能。 本文研究了以奶牛糞便為原料的沼氣發(fā)酵過程中的物料理化性質的改變、參與發(fā)酵過程的六大微生物生理群的數(shù)量變化。同時采

3、用不依賴于培養(yǎng)的16SrDNA分析的方法研究了沼氣發(fā)酵的不同階段沼液中產甲烷菌的多樣性的變化。并通過傳統(tǒng)的Hungate厭氧技術從發(fā)酵液中分離出產甲烷菌并進行了初步的鑒定。 一、沼氣發(fā)酵過程中主要微生物生理群的演替與物料的變化研究了以奶牛糞便為原料的沼氣發(fā)酵過程中六大微生物生理群(好氧產酸菌、厭氧產酸菌、好氧氨化菌、厭氧氨化菌、厭氧纖維素降解菌、產甲烷菌)數(shù)量的變化，以及在此過程中物料理化性質的變化。實驗表明：發(fā)酵前期，以好氧微

4、生物活動為主，隨著發(fā)酵的進行，厭氧微生物，特別是產甲烷菌的作用越來越顯著。 在發(fā)酵過程中，揮發(fā)性有機酸，全氮、pH、氧化還原電位都發(fā)生變化，其變化與沼液中微生物類群變化相關。 二、沼液總DNA的提取和純化方法通過直接提取法和間接提取法的比較，確立了從沼液中提取總DNA的方法。比較結果表明，盡管直接提取法的得率要高于間接法，但由于沼液樣品中的腐殖質等雜質的含量較高，經(jīng)過純化回收后的直接法提取的總DNA，仍無法通過PCR擴增

5、的方法得到所需的片斷，無法進行后續(xù)試驗。而間接法的得率雖然較低，但所得總DNA純度高，無需純化，即可進行后續(xù)操作。 三、沼氣發(fā)酵過程中產甲烷多樣性的變化采用不依賴于培養(yǎng)的16SrDNA分析的方法研究了沼氣發(fā)酵的不同階段產甲烷菌的多樣性的改變。首先提取了發(fā)酵前、發(fā)酵啟動期、盛產期前期、盛產期、發(fā)酵末期五個階段的沼液總DNA，應用產甲烷菌特異性的16SrDNA引物通過PCR擴增了五個階段的沼液樣品的總DNA，建立了五個沼液樣品16S

6、rDNA文庫，應用HaeⅢ-HpaⅡ兩種四堿基限制性核酸內切酶對五個文庫中的16SrDNA片段進行了限制性片段長度多態(tài)性分析。共獲得127種酶切類型。應用各種多樣性和均度參數(shù)對五個文庫HaeⅢ-HpaⅡ酶切類型的豐富度和分布進行了比較。對五個文庫的16SrDNA主要HaeⅢ-HpaⅡ酶切類型的系統(tǒng)發(fā)育分析表明產甲烷菌群落發(fā)生了顯著的變化。在發(fā)酵的五個不同階段都存在著相同的產甲烷菌類群—甲烷粒菌，而在五個階段也存在著各自不同的優(yōu)勢地位的產

7、甲烷菌類群，如發(fā)酵前的基質中主要的產甲烷菌類群為甲烷短桿菌(Methanobrevibacter)、甲烷螺菌屬(Methanospirillum)和甲烷微菌屬(Methanomicrobiaceae)以及未可培養(yǎng)的瘤胃甲烷菌(unculturedrumenmethanogen)的成員，而發(fā)酵啟動期、發(fā)酵盛產期初期、發(fā)酵盛產期的沼液中主要的產甲烷菌類群為甲烷球菌屬(Methanococcus)以及甲烷粒菌屬(Methanocorpuscu

8、lum)、甲烷八疊球菌屬(Methanosarcina)的成員。發(fā)酵末期的發(fā)酵液主要類群則屬于甲烷粒菌屬(Methanocorpusculum)、甲烷袋狀菌屬(Methanoculleus)和鬃毛甲烷菌屬(Methanosaeta)。這一結論表明，發(fā)酵起始時的優(yōu)勢種群并不是盛產期時的優(yōu)勢類群，也推翻了人們通常認為牛糞本身就含有產甲烷菌而無需調試的錯誤觀點。 四、發(fā)酵沼液中分離產甲烷菌的分離與初步鑒定采用Hungate厭氧技術分離

9、，從發(fā)酵前，發(fā)酵盛產期、發(fā)酵末期的沼液中各分離出一株產甲烷菌，經(jīng)生理生化鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析，初步在屬水平上講NY-1確定為Methanobrevibactersp.，NF-1確定為Methanoculleussp.，NW-1確定為Methanosaetasp.。所分離到的產甲烷菌是各階段的優(yōu)勢類群，但通過分子生物學方法分析得到的各階段的最優(yōu)勢類群往往并沒有通過分離技術得到。表明：與分子方法所得的結果既相關，又不完全一致。實際研究中，應該